1 Lover og forskrifter
3.4 Trafikklyssignaler
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5.1. Seleção da melhor fonte de carbono para produção enzimática
A atividade de poligalacturonase foi quantificada no sobrenadante da cultura de C.pteridis LPF-59 , contendo as diferentes fontes de carbono.
Figura 10. Atividade de poligalacturonase (U.mL-1) no sobrenadante da cultura de C.pteridis LPF-59 nas diferentes fontes de carbono. (■) resíduo de viveiro de eucalipto antigo, (■) resíduo de viveiro de eucalipto novo, (■) folha de eucalipto, (■) caule jovem de eucalipto, (■) caule lignificado de eucalipto e (□) farelo de trigo.
Todas as fontes de carbono testadas foram capazes de induzir a expressão de poligalacturonase por C.pteridis. Entretanto, o resíduo de viveiro antigo, o resíduo de viveiro novo e a folha de eucalipto se destacaram na indução da poligalacturonase em relação às demais fontes. Do conjunto de fontes de carbono testadas, cinco foram constituídas de material proveniente do eucalipto e uma foi composta por farelo de trigo, que é uma fonte de carbono padronizada para secreção de enzimas por fungos que degradam a parede celular de plantas.
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Uma vez que o fungo C. pteridis LPF-59 é fitopatogênico e foi isolado de plantações de eucalipto, era de se esperar que a utilização de diferentes partes do eucalipto para indução da atividade de poligalacturonase promovesse diferenças no perfil de atividade da enzima. .
O resíduo de viveiro compreende o ramo inteiro do eucalipto contendo a folha, o caule jovem e o caule lignificado em diferentes proporções. A proporção de pectina na parede celular de plantas varia de acordo com a parte do vegetal, o crescimento e principalmente a idade da planta. Esse último fator pode explicar a diferença de atividade da poligalacturonase obtida na cultura de C. pteridis contendo o resíduo de viveiro antigo e o resíduo de viveiro novo, uma vez que essas fontes de carbono foram recolhidas em épocas diferentes. Além disso, pode-se citar a diferença na proporção de folhas e caules em cada resíduo, o que consequentemente gera uma diferença na proporção de substrato disponível para indução da enzima.
Tanto a folha de eucalipto quanto o resíduo de viveiro antigo se destacaram como indutores da poligalacturonase em C. pteridis, tendo sido detectado aproximadamente 38 U.mL-1 em 120 horas de cultivo. Porém, a atividade para a folha de eucalipto aumentou, chegando a 42 U.mL-1 em 168 horas. Já para o resíduo antigo, a atividade permaneceu constante a partir de 120 horas de cultivo.
Uma vez que a folha de eucalipto foi a fonte que promoveu maior atividade de poligalacturonase por C.pteridis, e sendo um material mais homogêneo para utilização como fonte de carbono para o preparo do meio de cultura, a folha de eucalipto foi selecionada como sendo o possível indutor para os ensaios posteriores de produção da enzima por C.pteridis.
Quando a atividade da poligalacturonase de C.pteridis foi expressa em função da concentração de proteínas, a atividade específica foi maior no sobrenadante da cultura contendo o caule jovem de eucalipto e o caule lignificado de eucalipto (Figura 11).
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Figura 11. Atividade específica de poligalacturonase (U.mg-1) no sobrenadante da cultura de C.pteridis LPF-59 nas diferentes fontes de carbono. (■) resíduo de viveiro de eucalipto antigo, (■) resíduo de viveiro de eucalipto novo, (■) folha de eucalipto, (■) caule jovem de eucalipto, (■) caule lignificado de eucalipto e (□) farelo de trigo.
Caule jovem e caule lignificado de eucalipto promoveram a maior atividade específica, próxima a 500 U.mg-1 com 96 horas de cultivo, enquanto a atividade específica detectada no meio contendo folha de eucalipto, no mesmo tempo de cultivo foi de aproximadamente 300 U.mg-1. Entretanto, pode ser observado que a atividade específica nos meios contendo essas três fontes de carbono se tornaram equivalentes com 168 horas de cultivo, apresentando valores próximos a 370 U.mg-1.
A Tabela 1 contém os dados dos maiores valores de atividade de poligalacturonase detectados nos meios contendo as diferentes fontes de carbono e os respectivos tempos de cultivo.
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Tabela 1. Atividade de poligalacturonase detectada nos meios de cultura de C.pteridis contendo diferentes fontes de carbono.
Poligalacturonase
Fonte de carbono Atividade (U.mL-1) Atividade específica (U.mg-1)
Resíduo de viveiro antigo 39,54 ± 0,10 168* 387,06 ± 0,49 120 Resíduo de viveiro novo 32,53 ± 0,62 168 377,06 ± 0,31 96 Folha de eucalipto 42,28 ± 0,80 168 408,99 ± 0,29 144 Caule jovem de eucalipto 15,99 ± 0,72 96 532,94 ± 0,36 96 Caule lignificado de eucalipto 14,23 ± 0,71 96 506,09 ± 0,36 96 Farelo de trigo 14,00 ± 0,75 168 237,02 ± 0,38 168 (*) horas de cultivo apresentando maior atividade de poligalacturonase.
Visando a purificação da poligalacturonase de C.pteridis LPF-59 é importante obter um extrato enzimático com alta atividade específica. Sendo assim, partindo de uma amostra com alta atividade específica a purificação tende a ser mais eficiente. Dentro dessa perspectiva, o caule jovem e o caule lignificado seriam bons candidatos, pois induziram a maior atividade específica em 96 horas de cultivo. Porém, a folha de eucalipto, apesar de induzir menor atividade específica quando comparada ao caule jovem e lignificado, apresentou com 120 horas de cultivo uma atividade específica considerável (390 U.mg-1) e uma atividade em U.mL-1 aproximadamente 2,5 e 4 vezes maior
que o caule jovem e o caule lignificado, respectivamente.
Esse fator foi determinante para escolha da folha de eucalipto como a melhor fonte de carbono para produção da enzima por C.pteridis, uma vez que o fungo cultivado nessa fonte por 120 horas apresentou uma maior atividade (U.mL-1) aliada a uma atividade específica também alta.
Assim, as etapas posteriores de produção enzimática por C.pteridis foram realizadas em meio líquido contendo a folha de eucalipto como fonte de carbono por um período de 120 horas.
A Figura 12 mostra as equações e as linhas de tendência (preto) obtidas a partir dos dados de atividade de poligalacturonase de C.pteridis nos meios com as diferentes fontes de carbono
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Figura 12. Atividade de poligalacturonase real (colorido) e teórica (preto) de acordo com as diferentes fontes de carbono ao longo do tempo de cultivo. (A) Resíduo de viveiro de eucalipto antigo (B) Resíduo de viveiro de eucalipto novo (C) Folha de eucalipto (D) Caule jovem de eucalipto (E) Caule lignificado de eucalipto (F) Farelo de trigo.
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5.2. Purificação da poligalacturonase de C.pteridis LPF-59
A poligalacturonase de C. pteridis LPF-59 foi produzida a partir da inoculação do fungo em meio líquido contendo folha de eucalipto como fonte de carbono. Após 120 h de cultivo, o extrato enzimático foi então submetido ao processo de purificação (Tabela 2).
Tabela 2. Resumo das etapas de purificação da poligalacturonase de C.pteridis LPF-59. Etapa Volume (mL) Atividade total (U) Proteína total (mg) Atividade específica (U.mg-1) Rendimento (%) Fator de purificação Extrato bruto 40 1372,80 2,676 513,00 100 1 Troca Iônica 66 1055,34 0,390 2706,00 76,88 5,27 Ultrafiltração 11 477,40 0,072 6630,56 34,75 12,93 Gel Filtração 55 259,60 0,038 6831,58 18,91 13,32
Durante a cromatografia de troca iônica, DEAE-Sepharose, a eluição das proteínas que aderiram à resina foi feita pela aplicação de um gradiente crescente de NaCl, variando de 0 a 0,5 M. A eluição com o gradiente salino permitiu a detecção de apenas um pico proteico contendo atividade de poligalacturonase (Figura 13).
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Figura 13. Perfil cromatográfico obtido após a aplicação do extrato bruto centrifugado em coluna de troca iônica DEAE–Sepharose. Atividade poligalacturonase (●); Proteína Abs 280 nm (○); gradiente salino (−).
O perfil cromatográfico da troca iônica também revelou a eluição de grande parte das proteínas contaminantes antes da passagem do gradiente, o que justifica o aumento da atividade específica. Sendo assim, a cromatografia de troca iônica foi uma etapa eficiente no processo de purificação da poligalacturonase, pois a atividade específica aumentou aproximadamente 5 vezes em relação ao extrato bruto, com um rendimento de 76%.
As frações ativas reunidas provenientes da troca iônica foram concentradas por ultrafiltração, utilizando uma membrana com limite de exclusão de 3 KDa. Esta etapa promoveu um grande acréscimo nos valores de atividade específica das preparações enzimáticas, próximo a 2,5 vezes (Tabela 2), principalmente por promover a exclusão de fragmentos proteicos e de peptídeos de massa molecular menor que 3 KDa.
Posteriormente, a amostra concentrada foi submetida a uma cromatografia de filtração em gel, em uma coluna de Sepahcryl S-200. O perfil cromatográfico da filtração em gel está representado na Figura 14.
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Figura 14. Perfil cromatográfico obtido após a aplicação da fração ativa concentrada, proveniente da troca iônica, em coluna de gel filtração Sephacryl S-200. Atividade poligalacturonase (●); Proteína Abs 280 nm (○).
O perfil de eluição da cromatografia de filtração em gel também revelou a presença de apenas um pico de proteínas com atividade de poligalacturonase. As frações contendo atividade enzimática foram reunidas e armazenadas.
A presença de apenas um pico proteico contendo atividade de poligalacturonase ao longo das etapas do processo de purificação pode indicar a expressão de uma única enzima pelo fungo C.pteridis LPF-59 nas condições testadas.
Ao final do processo de purificação, a poligalacturonase de C.pteridis LPF-59 apresentou um fator de purificação de 13,32 vezes, com rendimento de 18,91 % (Tabela 2).
Para confirmar a purificação da poligalacturonase as amostras com atividade provenientes de cada etapa da purificação foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida 12% em condições desnaturantes (SDS- PAGE).
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O perfil de migração das proteínas presentes nas amostras está apresentado na figura 15.
Figura 15. Eletroforese desnaturante (SDS-PAGE 12 %) corado com prata das amostras com atividade de poligalacturonase de C.pteridis LPF-59. (A) 1- extrato bruto, 2 - fração enzimática proveniente da troca iônica, 3 - fração enzimática proveniente da filtração em gel e 4 – marcadores de massa molecular.
Confirmando os dados mostrados na Tabela 2, que indicam a eficiência de cada etapa do processo de purificação, foi também mostrado que as etapas de purificação renderam diminuição do número de bandas de proteínas, como visto na Figura 15. A amostra proveniente da última etapa do processo de purificação indicou a presença de uma única banda proteica. Esse resultado mostra que o processo de purificação estabelecido foi eficiente.
Entretanto, para determinação deste protocolo de purificação, resinas com diferentes princípios de fracionamento proteico foram utilizadas e analisadas quanto à viabilidade de aplicação no processo de purificação da poligalacturonase de C. pteridis. A recuperação da poligalacturonase em cada
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etapa deveria ser a melhor possível, sem afetar drasticamente a atividade enzimática e o seu rendimento.
5.3. Determinação da massa molecular
A massa molecular da poligalacturonase de C.pteridis LPF-59, estimada a partir do gel SDS-PAGE, foi de aproximadamente 68 KDa.
Figura 16. Determinação da massa molecular da poligalacturonase purificada de C.pteridis LPF-59, a partir de SDS-PAGE. Distâncias percorridas pelos padrões proteicos do marcador (♦) e pela poligalacturonase (●).
Valores de massa molecular próximos ao obtido neste trabalho, foram descritos na literatura para poligalacturonase fúngicas, como 68 KDa para a enzima de Sclerotinia sclerotiorum (Riou et al.,1992) e 60 KDa para poligalacturonase de Cochliobolus carbonum (Scott-Craig et al., 1998). Outras estimativas similares foram encontradas para duas isoformas da poligalacturonase do fungo fitopatogênico Botrytis cinerea, uma com massa molecular de 65 KDa e a outra com uma massa molecular de 52 KDa (Cabanne et al. 2002). Duas isoformas da poligalacturonase de Penicillium
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frequentans também foram identificadas nos estudos de Barense et al. (2001) e as massas moleculares estimadas foram 63 KDa e 79 KDa.
5.4. Caracterização enzimática
5.4.1. Efeito do pH
O efeito do pH sobre a atividade da poilgalacturonase de C.pteridis LPF- 59 contra o substrato ácido poligalacturônico foi avaliado conforme o item 4.11.1. De acordo com a figura 17, a atividade máxima para poligalacturonase foi determinada em pH 4,0. No pH 3,6, a enzima manteve atividade acima de 90%. Em valores acima do pH ótimo, a atividade decresceu continuamente, sendo que acima do pH 5,0 a enzima não manteve mais que 20% de atividade. Esse resultado indica que a poilgalacturonase de C.pteridis é uma enzima ácida e que em valores de pH acima de 6,0, provavelmente ocorre alteração na carga dos aminoácidos catalíticos presentes no sítio ativo da enzima, reduzindo drasticamente sua atividade.
pH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A tiv idade relat iv a ( % ) 0 20 40 60 80 100
Figura 17. Efeito do pH na atividade da poligalacturonase purificada de C.pteridis LPF-59 na temperatura de 50oC.
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A poligalacturonase de Penicillium solitum apresenta máxima atividade quando incubada em pH 4,0, sendo que esta enzima mantém atividade acima de 70% em uma faixa de pH compreendida entre 4,0 e 5,5 (Jurick et al., 2009). Quiroga et al.(2009) determinaram que a poligalacturonase de Pcynoporus sanguineus apresenta taxa máxima de hidrólise em pH 4,8.
A estabilidade da enzima após 60 minutos de incubação a 25oC em
diferentes valores de pH foi analisada conforme item 4.11.3. As atividades residuais da poligalacturonase de C.pteridis LPF-59 são mostradas na figura 18. pH 2 3 4 5 6 7 8 9 A tiv idade relat iv a ( % ) 0 20 40 60 80 100
Figura 18. Efeito do pH na estabilidade da poligalacturonase purificada de C.pteridis LPF-59 após 60 minutos de incubação a 25oC em diferentes valores de pH . Efeito do pH na atividade da poligalacturonase (●) e efeito do pH na estabilidade da poligalacturonase (○).
A enzima mostrou maior estabilidade quando incubada em pH 3,6 e 4,0. Além disso, a enzima manteve mais de 70% de sua atividade máxima quando incubada por 1h a 25oC em uma faixa de pH entre 3,6 e 6,0. Quando incubada em pH 2,6 e 7,6 a enzima reteve ainda 40% de sua atividade máxima. Os
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dados da estabilidade da enzima em diferentes valores de pH indicam que mesmo após pré-incubação da enzima em valores de pH acima de 6,0, esta foi capaz de renaturar e restabelecer parte da atividade. Entretanto a enzima manteve apenas 20% de sua atividade máxima quando pré-incubada em pH 8,0, logo este valor de pH demonstrou ser mais drástico para a estabilidade da enzima. Isso evidencia a habilidade da enzima para atuar em ambientes ácidos, característica apreciada nas indústrias alimentícias.
Aminzadeh et al. (2006) analisaram a estabilidade de uma poligalacturonase do fungo filamentoso Tetracoccosporium sp. em diferentes valores de pH, concluindo que a enzima exibe mais de 80% de atividade residual após 90 minutos de incubação a 25oC em uma faixa de pH compreendida entre 3,0 e 7,0. Penicillium viridicatum RFC3 produziu uma poligalacturonase que mantém mais de 70% de sua atividade máxima, após 24 horas de incubação a 25oC , em uma faixa de pH entre 4,0 e 6,0
Segel (1979) descreve que os efeitos do pH na estabilidade de uma enzima devem ser levados em conta, uma vez que o pH interfere na ligação do substrato e na catálise. Além disso, a curva para determinação do pH ótimo não fornece informações suficientes a respeito do comportamento da atividade enzimática acima e abaixo do pH ótimo. O declínio da atividade enzimática abaixo ou acima do pH ótimo de atuação da enzima pode ser resultado da inativação da enzima ou de uma forma iônica não adequada do substrato e da enzima ou de um dos dois.
Logo, o declínio da atividade da poligalacturonase de C.pteridis LPF-59 nas faixas de pH abaixo de 3,0 e entre 4,6 e 8,0 pode ser devido a uma mudança conformacional não adequada da enzima, o que diminuiu sua eficiência catalítica.
5.4.2. Efeito da temperatura
O efeito da temperatura sobre a atividade da poligalacturonase do fungo C.pteridis LPF-59 contra o substrato ácido poligalacturônico foi avaliado conforme o item 4.11.2 e está representado na figura 19.
45 Temperatura 10 20 30 40 50 60 70 80 90 A tiv idade relat iv a ( % ) 0 20 40 60 80 100
Figura 19. Efeito da temperatura na atividade da poligalacturonase purificada de C.pteridis LPF-59 em pH 4,0.
A enzima exibiu máxima atividade quando ensaiada a 60oC, sendo que a 55 e 65 oC a atividade da enzima foi maior que 70%. Atividades próximas a 60% foram observadas em 45 e 50oC. Nas temperaturas 40, 70 e 75oC, a enzima exibiu aproximadamente 50% de sua atividade máxima. No entanto, a enzima incubada a 80oC não apresentou atividade maior que 35%. Esse comportamento também foi observado para temperaturas abaixo de 35oC.
Em temperaturas maiores que 60oC, a atividade da enzima diminui continuamente, provavelmente devido às alterações estruturais na enzima afetando a sua ligação com o substrato.
A poligalacturonase de Pyconoporus sanguineus estudada por Quiroga et al. (2009) exibiu máxima atividade quando ensaiada em uma faixa de temperatura entre 50 -60oC. O estudo de duas isoformas da poligalacturonase
do fungo Penicillium frequentans indicaram atividade máxima quando incubadas a 50oC (Barense et al., 2001).
Algumas poligalacturonases apresentam atividade máxima em temperaturas mais brandas, como a poligalacturonase produzida pelo fungo
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Penicillium solitum. Estudos com essa enzima determinaram atividade máxima nos intervalos de temperatura entre 20 e 37oC. Acredita-se que a máxima atividade em baixas temperaturas possa facilitar a invasão e a colonização do micro-organismo na planta hospedeira durante o período frio (Jurick et al., 2009).
A máxima atividade da poligalacturonase de C.pteridis LPF-59 a 60 oC é
uma propriedade importante do ponto de vista industrial, principalmente para possíveis aplicações dessa enzima na indústria de sucos e bebidas. Na maceração da uva para extração do suco, por exemplo, a incubação a 60-65
oC promove o rompimento da membrana e rupturas na parede celular do fruto,
facilitando a liberação do líquido e das antocianinas responsáveis pela cor do suco (Gomes et al., 2007).
5.4.3. Análise da termoestabilidade
A termoestabilidade da poligalacturonase purificada de C.pteridis LPF-59 foi avaliada nas temperaturas de 50 e 60 oC como descrito no item 4.11.4.
Tempo (min) 0 200 400 600 800 A tiv idade relat iv a ( % ) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Figura 20. Efeito da temperatura na estabilidade da poligalacturonase purificada de C.pteridis LPF-59. As amostras enzimáticas foram pré-incubadas
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nas temperaturas de 50oC (●) e 60oC (). As atividades relativas foram
calculadas considerando-se a atividade sem pré-incubação como 100 %.
A poligalacturonase permaneceu com aproximadamente 90% de sua atividade inicial nos primeiros 30 minutos de incubação a 50oC, entretanto, a
60oC, a enzima manteve 90% de atividade nos primeiros 20 minutos de
incubação. Após 60 minutos de incubação, a enzima manteve 44% e 77% de sua atividade a 60oC e a 50o C, respectivamente. Após 120 minutos a 60oC, a
poligalacturonase apresentou 38% de sua atividade inicial, sendo que após esse mesmo tempo de pré-incubação a 50oC a enzima ainda mantinha 69 % de atividade residual. Gadre et al. (2003) descreveram uma poligalacturonase de Mucor flavus que foi completamente inativada com 30 minutos de incubação a 55oC, entretanto a 45oC, a enzima retinha 80% da sua atividade inicial após 4 horas de incubação. Já a poligalacturonase de Mucor circinelloides apresentou 71% de atividade inicial após 2 horas de incubação a 42oC e após 7 horas ainda manteve 42% da sua atividade inicial. Porém, quando incubada a 50oC sua atividade foi de apenas 22 % com 5 horas de incubação (Thakur et al., 2010). Muitas poligalacturonases perdem rapidamente a atividade em temperaturas acima de 50oC, devido à desnaturação da enzima e consequente perda da eficiência de catálise.
A poligalacturonase de C.pteridis LPF-59 se mostrou bastante termoestável a 50oC. Essa característica a torna interessante para aplicação
industrial, visto que muitos processos biotecnológicos são conduzidos em elevadas temperaturas. Para isso, essas enzimas necessitam manter a estabilidade ao longo de todo processo. Sabe-se que altas temperaturas favorecem a solubilidade dos substratos e dos produtos, aumentam as taxas de reação devido à redução da viscosidade e ao aumento do coeficiente de difusão dos substratos (Gomes et al., 2007). Além de aumentar a produtividade, as reações conduzidas em temperaturas elevadas reduzem a contaminação microbiana. Logo, poligalacturonases termoestáveis têm sido objeto de inúmeros estudos envolvendo a elucidação de mecanismos de desnaturação térmica e o desenvolvimento de estratégias para aumento da estabilidade (Aminzadeh et al., 2006).
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5.4.3.1. Meia-vida da poligalacturonase
Os valores de meia-vida da poligalacturonase purificada de C.pteridis LPF-59 a 50oC e a 60oC foram de 260 e 66 minutos, respectivamente (Figura
21). Tempo (min) 0 200 400 600 800 At iv idade relativ a (% ) 0 20 40 60 80 100 Tempo (min) 0 20 40 60 80 100 120 140 At iv idade relativ a (% ) 0 20 40 60 80 100
Figura 21. Valores de meia-vida estimados para poligalacturonase purificada de C.pteridis LPF-59 em temperaturas de (A) 50 °C, (B) 60 °C.
A Y = 95,8660*e (-0,0025x) r2 = 0,9846 B Y = 102,8204*e (-0,0108x) r2 = 0,9036
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Estudos realizados por Thakur et al. (2010) determinaram a meia-vida para poligalacturonase de Mucor circinelloides de 2 horas a 50oC. Aminzadeh et al. (2006) indicaram em seus estudos que a poligalacturonase do fungo Tetracoccosporium sp. exibiu meia-vida de 63 minutos a 60oC, valor bem próximo ao encontrado para a poligalacturonase identificada neste trabalho.
5.4.4. Determinação dos parâmetros cinéticos
O efeito da concentração dos substratos ácido poligalacturônico e pectina cítrica sobre a atividade da enzima poligalacturonase do fungo C.pteridis LPF-59 foi avaliado conforme item 4.11.5.
Os valores das constantes cinéticas KM, bem como os valores Vmax e da
relação Vmax.KM-1 obtidos para a enzima contra os dois diferentes substratos
testados pode ser observado na tabela 3.
Tabela 3. Valores de KM, Vmax e Vmax.KM-1 obtidos para poligalacturonase
purificada de C.pteridis LPF-59, determinados pela curva de Michaelis-Menten para os substratos ácido poligalacturônico e pectina cítrica.
Poligalacturonase
Substrato KM (mg.mL-1) Vmax (U.mL-1) Vmax.KM-1 (U.mg-1) Ácido poligalacturônico 0,525 5,862 11,174
Pectina cítrica 6,770 16,167 2,388
Todos os parâmetros cinéticos apresentados neste trabalho foram obtidos por ajuste da equação de Michaelis-Menten (V=(Vmax . [S]) . (KM + [S])-1)
a um conjunto de dados que relacionava velocidade de hidrólise vs concentração de substrato.
Segel (1979), afirma que a constante cinética KM indica a
“adequacidade” relativa de diferentes substratos para uma determinada enzima, ou seja, o substrato que apresenta o menor valor de KM possui uma
maior afinidade aparente para a enzima. Da mesma maneira, o valor da relação Vmax.KM-1, pode ser utilizado como um parâmetro de comparação para
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medir a eficiência catalítica de uma enzima para diferentes substratos , sendo que, valores maiores da relação Vmax.KM-1 indicam uma maior eficiência
catalítica.
Sendo assim, a poligalacturonase de C.pteridis LPF-59 apresentou maior afinidade pelo substrato ácido poligalacturônico, comparada ao substrato pectina cítrica. Esse comportamento é confirmado também pela relação Vmax.KM-1, que indica uma maior eficiência catalítica da enzima sobre o ácido
poligalacturônico.
É frequentemente observado na literatura, que as poligalacturonases apresentam maior afinidade pelo ácido poligalacturônico. Quiroga et al. (2009), avaliando uma poligalacturonase produzida por Pyconopporus sanguineus, determinaram um KM de 0,55 mg.mL-1 para ácido poligalacturônico, sendo que
o KM para pectina cítrica foi de 0,72 mg.mL-1. Além disso, a eficiência catalítica
(Vmax.KM-1) da enzima do P.sanguinueus demonstrou ser maior para ácido
poligalacturônico do que para pectina cítrica.