4. Integrering, assimilering og segregering
4.4 Tilhørighet til kirkesamfunn
A técnica de congelamento seminal mais difundida em peixes utiliza vapores de nitrogênio líquido, sendo a velocidade de congelamento um dos fatores mais críticos e menos padronizado do processo. No presente estudo não foi possível padronizar uma curva de congelamento em graus por minuto usando a geladeira de isopor porque todas as curvas foram diferentes entre si. Lahnsteiner e Patzner (1996) afirmaram que isto acontece pela rápida evaporação do nitrogênio líquido quando do uso de sistemas abertos, como as caixas de congelamento. Apesar disso, Cruzet al. (2004) congelando neste método a 3 cm (-76°C) do nitrogênio líquido e Deandro et al. (1997) a 2 cm (-148°C), 6.5 cm (-99°C) e 13 cm (-46°C), encontraram motilidades acima de 55%.
Taxas adequadas de congelamento não podem ser generalizadas, pois diferentes diluentes, tamanhos de palhetas e temperaturas têm sido utilizadas com sucesso (Lahnsteiner, 2000). Taxas de congelamento ótimas foram obtidas entre 5 e
para o sêmen de tilápia. O “dry shipper” utilizado neste estudo foi igualmente satisfatório para a criopreservação de sêmen de vários peixes neotropicais a uma taxa de congelamento de 30°C/min (Carolsfeld et al., 2003). No congelamento do sêmen de pirapitinga se obteve uma taxa boa de congelamento de -14°C/min comparável com a de Riley et al. (2004) a -16°C/min, chegando até -140°C, onde os espermatozóides alcançaram motilidades de 80%. Tais fatos demonstram que os espermatozóides da espécie em questão são pouco tolerantes às mudanças de temperatura durante o congelamento (caixa de isopor), talvez devido à desestabilização das membranas, danos físicos no citoplasma e nas membranas nucleares resultantes da formação de cristais de gelo intracelular (Kang et al., 2004).
O uso das palhetas francesas simplificou e acelerou a manipulação durante o envase, congelamento e descongelamento do sêmen criodiluído, apesar do tamanho da palheta aparentemente influenciar a motilidade do sêmen descongelado da pirapitinga. Verificou-se que a porcentagem de espermatozóides móveis praticamente dobrou entre as palhetas de 0,25 e 0,5 mL, sendo esta última a melhor. Carolsfeld et al. (2003) e Maria et al. (2006) verificaram que a palheta de 0,5 mL é a mais prática para a maioria de espécies, apresenta os melhores resultados e é a mais apropriada para bancos genéticos (Lahnsteiner, 2000). Ninhaus-Silveira et al. (2006) por sua parte, ao congelar sêmen de Matrinhã em palhetas de 4 ml e 0,5 mL, não encontrou diferenças significativas no momento de descongelar, mesmo que os valores de fertilidade tenham sido um pouco melhores na palheta de 0,5 mL. Enquanto Medina et al. (2007) observou, em palhetas de 0,5 mL, motilidades espermáticas e porcentagens de fertilidade significativamente inferiores às observadas em volumes de 1,8 , 2,5 e 4 mL.
Supõem-se que o sêmen que foi acondicionado em palheta de 0.25 mL tenha passado por um longo platô do ponto de congelamento (ponto de calor residual liberado, onde os cristais de gelo são formados por uma subida na temperatura dentro da palheta) ou por uma faixa de congelamento lenta pelo volume da palheta, similarmente ao ocorrido nos trabalhos de Richardson et al. (1999) e Velasco- Santamaria et al. (2006). Devido à temperatura na caixa de congelamento variar constantemente e existir uma associação direta entre a duração do platô do ponto de congelamento e o diâmetro da palheta na viabilidade do congelamento- descongelamento dos espermatozóides, uma redução na duração deste platô
2006). As mudanças na estrutura e viabilidade dos espermatozóides durante o processo de congelamento são principalmente influenciados pela longitude do pico de calor latente, ocasionado pela liberação do calor de fusão que, ao ser liberado retorna a sua temperatura original, que tarda um pouco mais em palhetas de maior volume (Richardson et al., 1999) sendo mais homogêneo nas de 0,5 mL.
A utilização de palhetas de maior tamanho auxilia nos processos de fertilização artificial em escala comercial devido principalmente aos grandes volumes de ovócitos desovados pelas espécies tropicais cultivadas. Mas, devido à importância da diversidade genética dos peixes produzidos em cativeiro, não se recomenda o uso de palhetas grandes, já que o mais importante é conservar a variabilidade genética em detrimento à quantidade de sêmen criopreservada (Carolsfeld et al., 2003).
Foi observado que as amostras diluídas em meio contendo DMSO pós- descongelamento, de maneira geral, apresentaram as maiores porcentagens de espermatozóides móveis, aproximando-se àquelas observadas no sêmen não diluído. Esta substância tem sido um crioprotetor efetivo para outros espermatozóides de teleósteos (Piironen, 1993; Bart et al., 1998; Suquetet al., 2000; Melo e Godinho, 2006). Mas em algumas outras espécies, como no caso da tilápia- nilótica (Oreochromis niloticus) não foi tão efetivo como o metanol (Godinho et al., 2003). Em outras pesquisas realizadas com a mesma espécie do presente estudo, os resultados apresentaram motilidades superiores às observadas por Navarro et al. (2004) e inferiores às de Fresneda et al. (2004) (40% e 80%, respectivamente), ambos os trabalhos utilizando DMSO, glicose e gema de ovo. Isto indica que, neste caso, o crioprotetor foi suficiente para induzir a saída de água da célula, impedindo a formação de gelo intracelular, sem produzir retração pela desidratação da célula.
O metilglicol, ao contrário, apresentou as taxas de motilidade mais baixas pós- descongelamento, contradizendo aos resultados de Maria (2005), que testou o metilglicol pela primeira vez como agente crioprotetor em sêmen de piracanjuba e dentre os crioprotetores testados, mostrou ser o mais indicado para a criopreservação do sêmen dessa espécie.
Nenhum dos meios diluentes testados neste experimento (Ringer, ACP-104 e Glicose) proporcionou valores superiores a 62% de motilidade progressiva, sendo os resultados com glicose um pouco melhores. Murgaset al. (2001) destacaram o uso
do sêmen de piracanjuba, apresentando 60% de motilidade pós-descongelamento no diluente água de coco industrializada. Resultados similares foram relatados por Carvalho (1999) e Farias et al. (2000) com sêmen de tambaqui e carpa diluídos em meio diluente à base de água de coco in natura (acima de 50%). É provável que na criopreservação do sêmen de pirapitinga o meio diluente à base de água de coco em pó (ACP-104) não tenha oferecido um ambiente iônico favorável, embora tenha apresentado motilidades representativas, com maior quantidade de espermatozóides móveis.
A glicose é um meio diluente que tem sido satisfatoriamente utilizado para a criopreservação do sêmen de várias espécies de peixes como o bagre africano Clarias gariepinus (Urbányi et al., 1999), várias espécies de esturjão (Tsvetkova et al., 1996; Glogowski et al., 2002) e a bijupira Rachycentron canadum (Caylor et al., 1994), dentre outras. O sucesso deste meio diluente pode ser explicado pelo seu papel como crioprotetor externo estabilizador de membrana (Maisse, 1994) e como substrato para a síntese de ATP (Murgas et al., 2007). Segundo Cosson et al. (1999), a fosforilação oxidativa mitocondrial é altamente requerida para a produção de energia durante o batimento flagelar dos espermatozóides, de modo que a insuficiência de ATP constitui uma das principais causas da redução da motilidade.
Igualmente este meio diluente é utilizado como um componente semelhante ao plasma seminal, que possui em sua composição açúcares como a frutose, a sacarose, etc. (Maisse et al., 1998). Em um estudo comparativo com a truta arco-íris foi relatado que os efeitos da sacarose, da frutose, da galactose e da glicose incorporadas a 125 mM como meio diluente são semelhantes quanto à motilidade seminal (Maisse, 1994). É possível que, neste estudo, os espermatozóides de pirapitinga metabolizem prioritariamente a glicose como fonte de energia e sua concentração tenha sido adequada para suprir as necessidades metabólicas das células espermáticas.
Pôde ser observado que as velocidades espermáticas (VCL, VSL e VAP) diminuíram consideravelmente nos experimentos 2 e 3 o que pode estar relacionado com o momento da ativação pós-descongelamento e com os parâmetros preestabelecidos no sistema CASA no momento da leitura.
No primeiro caso, os recursos energéticos dos espermatozóides de peixes são limitados; um incremento na velocidade causado por aumento de temperatura leva a
temperatura no momento da ativação resulta no prolongamento da duração da motilidade e na redução da velocidade espermática. Em truta arco-íris a freqüência de batimento flagelar é menor a 5°C, permanecendo constante a 10°C, aumentando rapidamente em torno de 14°C e se estabilizando a temperaturas maiores que 21°C (Hadi e Cosson, 2005). É possível que a temperatura da solução ativadora não tenha permanecido estável devido às variações na temperatura ambiente do laboratório, onde algumas vezes aumentava ou diminuía dependendo da hora e do dia das avaliações. Uma vez que estas sustâncias permanecem conservadas sob refrigeração, é possível que não se tenha aguardado o tempo necessário requerido para sua estabilização antes de sua utilização, podendo então ter influenciado a cinética espermática.
No segundo caso, os parâmetros do CASA devem ser estabelecidos dependendo ao tipo do movimento (linear, circular ou aleatório) que apresentem os espermatozóides ao serem descongelados porque, aparentemente, existe uma influência do padrão de movimento sobre o número de quadros avaliados quanto aos parâmetros cinéticos. Ravinder et al. (1997) monitoraram os parâmetros em 25 e 60 Hz, variando a VCL de 126 a 152 µm/s, a VSL de 31 a 148 µm/s e a VAP de 106 a 142 µm/s entre os padrões e as taxas. Também Toth et al. (1995) afirmaram que os parâmetros de velocidade quando são monitorados em uma maior taxa de quadros leva a um incremento na VCL e na VSL. Seria necessário realizar futuros experimentos testando essas duas taxas para se avaliar a possível influência sobre a velocidade dos espermatozóides descongelados de pirapitinga.
7.4. Análise morfológica do sêmen
O colorante azul de bromofenol é um tipo de corante vital que já foi efetivo na avaliação de espermatozóides ovinos e bovinos (Amaral, 2004) e cuja função é propiciar a visualização de espermatozóides vivos e mortos, além de diferenciar suas estruturas. À medida que os espermatozóides sofrem danos, a membrana espermática torna-se permeável e ficam coradas de azul, com maior intensidade nos espermatozóides que apresentam maiores danos estruturais (Sierra, 2005). No caso dos espermatozóides de pirapitinga não foram avaliadas as porcentagens de espermatozóides vivos e mortos, pela dificuldade de visualização dos tonos de
espermáticas.
Referente às características estruturais dos espermatozóides de pirapitinga, Piaractus brachypomus, foi observado que este apresenta o padrão ancestral, característico das espécies com fecundação externa, sendo muito semelhante aos espermatozóides descritos nas demais espécies da ordem Characiformes. Eles são constituídos por cabeça arredondada, sem acrossoma, peça intermediária curta (poucas mitocôndrias) e flagelo longo, semelhante ao descrito para outros peixes teleósteos (Romagosaet al., 1999; Vicentini, 2002; Pompiani, 2003).
No presente estudo, a leitura realizada dos esfregaços de sêmen a fresco com azul de bromofenol mostrou 31% de espermatozóides com morfoanomalias na cabeça, peça intermediária e cauda, quando considerados os defeitos maiores e menores em conjunto. Segundo Kavamoto et al. (1999), em curimbatá (Prochilodus scrofa) a porcentagem de morfoanomalias espermáticas foi de 9,5%. Já Prieto (2004) reportou 2,5% para piracanjuba, 3,4% para jundiá e 4% para piraputanga. Contrariamente, Moraes et al. (2004) obtiveram resultados similares aos do presente estudo, com 38% de morfoanomalias na carpa, 49% no piavuçu e 40% na curimbatá, sendo as mais freqüentes cabeça solta, cauda solta, cauda enrolada e cauda degenerada ou dobrada. O sêmen fresco de pirapitinga pode refletir estas morfoloanomalias nos espermatozóides tanto por variações ambientais e genéticas (Miliorini, 2006) como por falhas durante a espermatogênese, no caso das anormalidades primárias (cauda enrolada) ou durante a passagem do sêmen pelo epidídimo, no caso das secundárias (cauda dobrada) (Moraes et al., 2004).
No caso do sêmen pós-descongelamento não foram observadas diferenças estatísticas entre tratamentos e/ou diluições, apesar de que existiu um aumento de 13% nas morfoanomalias em relação ao sêmen a fresco. Tal aumento não foi considerado alto em relação ao apresentado no sêmen de pacu (P. mesopotamicus) descongelado com DMSO+glicose+gema de ovo (87%), com 50% de alterações primárias e 37% de alterações secundárias (Streit Jr. et al., 2006). Enquanto em curimba (Prochilodus lineatus) tanto com metanol como com DMSO 10% foram observadas alterações morfológicas primárias de 24,4% e secundárias de 1,4%.
Em mamíferos, de acordo com Hafez e Hafez (2000), de um modo geral, as morfoanomalias secundárias, como cauda quebrada e solta, além de cabeça solta, podem estar relacionadas à preparação dos esfregaços, e as anormalidades
acham que as alterações primárias podem ter uma resposta negativa a uma exposição hiposmótica, como no caso do sêmen de carpa que, depois de diluído em água doce, apresenta o flagelo enrolado na ponta (Tsvetkova et al., 1996) ou no esturjão siberiano que apresentou pressão osmótica do plasma seminal de 38 mOsm/kg induzindo a uma alteração discreta que só se veria no momento do descongelamento. As alterações de flagelo são menos prejudiciais que as de cabeça porque a maioria poderia ainda mover-se e chegar a fecundar um ovócito (Billard et al., 2000). Enquanto que as alterações de peça intermediária são conseqüência da desestabilização das membranas lipoprotéicas dos espermatozóides, sobretudo das mitocôndrias, por influência do congelamento (Miliorini, 2006), causando alterações progressivas na motilidade, aumentando o número de espermatozóides com movimentos circulares ou oscilatórios e, conseqüentemente, diminuindo a taxa de fertilização (Kavamoto et al., 1999). Esta morfoanomalia foi encontrada em baixa proporção, da mesma forma que a presença de gotas citoplasmáticas. Uma distribuição anormal das mitocôndrias na peça intermediária poderia impedir a liberação da gota citoplasmática durante o processo de maturação celular (Amaral, 2004). Para melhor aquilatar a capacidade de fecundação dos espermatozóides descongelados, seria necessário a avaliação do estado da membrana espermática através de metodologias mais específicas como sondas fluorescentes, citometria e fluxo e microscopia eletrônica.
Os machos de pirapitinga se apresentaram como peixes que apresenta fácil liberação de sêmen após o processo de indução hormonal, com concentrações espermáticas satisfatórias para utilização em protocolos de criopreservação e fertilização;
As observações direta subjetiva ou a objetiva, através de métodos de análise seminal auxiliado por computador (CASA), foram satisfatórias para a estimativa da motilidade espermática das pirapitingas;
O sêmen de pirapitinga pode ter um tempo de latência resfriado a 4ºC por 15 minutos, quando diluído em Ringer acrescido de metilglicol a 10% na diluição de 1:3, apresentando baixos níveis de toxicidade refletidos nos parâmetros cinéticos espermáticos;
O sêmen de pirapitinga pode ser satisfatoriamente congelado na criosolução Glicose 5% + DMSO 10% utilizando a técnica de congelamento em “dry shipper” em palhetas de 0,5 mL;
As melhores diluições dos tratamentos com maiores motilidades foram 1:7 para a Glicose 5% + DMSO 10%, seguido da diluição 1:3 do tratamento ACP- 104 + DMSO 10%;
As principais morfoanomalias apresentadas no sêmen a fresco de pirapitinga são do tipo secundárias, como cauda dobrada, as quais não afetariam substancialmente as taxas de fecundação; já no sêmen descongelado foram detectadas algumas morfoanomalias primárias como cauda enrolada e alterações na peça intermediária;
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