Para identificar as isoformas glicoprotéicas de fosfolipase, os géis de eletroforese bidimensional foram corados com o kit Pro-Q Emerald 300 (Dye Molecular Probes) como descrito por Steinberg et al. (2001). Esse corante se liga aos grupos de carboidratos oxidados pelo periodato, gerando um sinal flurescente nas glicoproteínas. Antes da fixação das proteínas em 50% metanol (v/v), as glicoproteínas separadas no gel foram oxidadas a aldeídos por incubação em solução contendo ácido periódico 1% (v/v) e ácido acético 3% (v/v), durante 30 minutos à 25°C. Após essa etapa, o gel foi incubado com o corante Pro-Q Emerald 300 durante 120 minutos à 25°C sob leve agitação. As proteínas glicosiladas foram visualizadas por iluminação de luz ultravioleta a 300 nm e fotodocumentado pelo sistema de documentação para géis de eletroforese VDS Image Master (Amersham Biociences -GE).
3.13. Identificação das Proteínas
As seqüências de proteínas obtidas pelo Sequenciamento Automático por Química Degradativa de Edman foram submetidas na ferramenta de bioinformática “BLAST” da página de internet do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas (NCBI – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Os parâmetros de buscas utilizados nesse estudo foram: Matrix PAM 30 e o banco de dados SwissProt.
Capítulo 3
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados iniciais da purificação das fosfolipases revelaram que havia um número grande de diferentes isoformas de fosfolipases, indicando que a purificação de uma isoforma específica poderia ser muito difícil, desde que elas são estruturalmente similares entre si e, conseqüentemente, deveriam apresentar propriedades bioquímicas e físico-químicas similares, dificultando a purificação individual de cada isoforma, e, por conseguinte dificultando seu sequencimento primário. Dessa forma, decidiu-se clonar e sequenciar o gene da fosfolipase A1 da vespa P. paulista, começando pelo RNAm dessa enzima,
para conhecer a seqüência primária completa dessa enzima do veneno da P. paulista. O cDNA possui 969 nucleotídeos, correspondendo a uma proteína de 322 resíduos de aminoácidos, conforme mostrado na Figura 1. Quando a seqüência de aminoácidos foi submetida ao algorítmo “SignalP- Prediction of
signal peptide cleavage sites” (http://www.cbs.dtu.dk/services/signalP/) foi
indicado que a enzima ativa deve conter 305 resíduos de aminoácidos e apresenta uma seqüência sinal de 12 resíduos de aminoácidos, que por sua vez é seguida de uma seqüência propeptídica de 5 resíduos (na Figura 1, essas seqüências sinais estão marcadas de cinza claro e escuro, respectivamente). Quando a seqüência da enzima madura (ativa) foi traduzida à partir do cDNA e avaliada pela Lipase Engineering Database (http://www.led.uni-stuttgart.de) (FISHER et al., 2003), a mesma foi classificada como uma lipase da classe GX, uma liproteína da superfamília das Lipases, homóloga às lipases pancreáticas, pertencente ao sub-grupo RP2 das fosfolipases.
Capítulo 3
FIGURA 1: Seqüência do cDNA e sua tradução na forma de seqüência primária de aminoácidos para a Fosfolipase A1 do veneno da vespa social P. paulista. A
região marcada de cinza claro indica o peptídeo sinal, enquanto que a região marcada em cinza escuro indica o propeptídeo. O códon de finalização está indicado por *.
O alinhamento da seqüência primária da fosfolipase A1 de P. paulista
com 12 outras lipases conhecidas, incluindo algumas fosfolipases de venenos de vespas sociais, está mostrado na Figura 2. As seqüências das enzimas na Figura 2 são utilizadas como referências de diferentes sub-grupos de lipases: fosfolipase A1 humana (fosfatidilserina – PS), fosfolipase suína (PLRP2), lipase
Capítulo 3
pancreática humana (PL), lipase de células endoteliais humana (EDL), lipase lipoprotéica humana (LPL) e lipase hepática humana (HL). Algumas enzimas de vespas foram incluídas nessa comparação: fosfolipase A1 de Vespula
germânica (PLA1_VESGE), fosfolipase A1 de Vespula maculifrons
(PLA1_VESMC), fosfolipase A1 de Vespula vulgaris (PLA1_VESVU),
fosfolipase A1 de Dolichovespula maculata (PLA1_DOLMA), fosfolipase A1 de
Polistes anularis (PLA1_POLAN), fosfolipase A1 de Polistes dominulus
(PLA1_POLDO) e fosfolipase A1 de Polybia paulista (PLA1_POLPA). As
regiões de identidade mais importantes estão assinaladas em preto, enfatizando os resíduos altamente conservados nesse tipo de alinhamento. Como membro da família das lipases pancreática humana, a fosfolipase A1 do
veneno da vespa Polybia paulista tem uma tríade catalítica, composta pelos resíduos Ser, Asp e His, os quais estão indicados na Figura 2 por estrelas. Na seqüência original da PL humana, as posições são Ser167, Asp191 e His275; na fosfolipase A1 da P. paulista, essas posições são Ser153, Asp181 e His250. Na
Figura 2, esses resíduos aparecem como Ser182, Asp210 e His295 devido à
Capítulo 3
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Muitos membros da família das lipases apresentam loops denominados lids e 9, os quais protegem o sítio ativo e parecem estar envolvidos com o reconhecimento do substrato (AOKI et al., 2002). Na Figura 2, o alinhamento dessas seqüências revela que, enquanto que as enzimas PL, PLRP2, EDL, LPL e HL apresentam os loops lids e 9 longos, as fosfolipases A1 do veneno
de vespas (incluindo a enzima da P. paulista) têm loops lids e 9 reduzidos. Outro aspecto estrutural que pode ser observado na Figura 2 foi a conservação dos resíduos de cisteínas; na família da PL humana, esses resíduos são conservados nas posições 259, 293, 318, 329, 332 e 340, enquanto que entre as fosfolipases A1 dos venenos de vespas, somente cisteínas das posições
259, 293, 332 e 340 permaneceram conservadas. As fosfolipases A1 do veneno
de vespas ainda apresentam os resíduos de cisteínas nas posições 308, 311 e 312, típicas desse subgrupo de enzimas.
A Figura 3 mostra o alinhamento das seis seqüências primárias de fosfolipases A1 de veneno de vespas de espécies endêmicas do hemisfério
norte (PLA1_VESGE, PLA1_VESMC, PLA1_VESVU, PLA1_DOLMA,
PLA1_POLAN e PLA1_POLDO), em comparação com a enzima da espécie de vespa endêmica da região neotropical (PLA1_POLPA). Considerando cada enzima em suas formas ativas, a identidade observada com a PLA1_POLPA foi: 63% de identidade com a PLA1_VESGE, 64% com a PLA1_VESMC, 60% com a PLA1_VESVU, 53% com a PLA1_DOLMA, 80% com a PLA1_POLAN e 82% com a PLA1_POLDO.
Capítulo 3
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Para caracterizar a PLA1_POLPA, o veneno bruto da vespa P. paulista foi submetido a duas etapas de cromatografia de troca iônica; a primeira etapa de fracionamento foi por cromatografia de troca catiônica numa coluna Hiprep FF CM (160 mm x 10 mm, 20 mL – Amersham Biosciences - GE), sob gradiente de 0 a 1 M de NaCl em tampão Acetato de Sódio 50 mM, pH 5,2. A Figura 4 mostra o perfil cromatográfico, apresentando sete picos denominados de A a G, os quais foram submetidos aos ensaios de atividade fosfolipásica, revelando que a enzima estava concentrada principalmente nos picos A e E. Deve ser enfatizado que ambos os picos eluiram em concentrações diferentes de NaCl; o pico A eluiu na ausência de NaCl, enquanto que o pico E eluiu quando a concentração de NaCl estava em torno de 0,63 M.
FIGURA 4: Perfil cromatográfico por Troca Catiônica do veneno bruto da vespa social P. paulista. O fracionamento foi realizado em coluna semi-preparativa Hiprep FF CM (160 mm x
10 mm, 20 mL – Amersham Biosciences - GE), previamente equilibrada e eluída até os primeiros 20 minutos com tampão Acetato de Sódio 50 mM, pH 5,2, e então sob um gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl no mesmo tampão de 20,01 a 180,00 minutos, num fluxo de 2 mL/,min; frações de 2 mL foram coletadas. A eluição foi monitorada por medidas de absorbância a 280 nm. A eluição das proteínas está representada pela linha contínua ( ____ ), enquanto que a linha (o ... o) representa a atividade fosfolipásica e (---) representa o gradiente de NaCl.
As frações correspondentes aos picos A e E foram reunidas, liofilizadas e submetidas a eletroforese unidimensional, onde o gel foi corado com CBB,
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picos foram individualmente submetidos à recromatografia por troca aniônica, numa coluna HiTrap Q (16 mm x 25 mm, 1 mL – Amersham Biosciences - GE) sob eluição isocrática nos três primeiros minutos com tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8, seguida por um gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl em tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8 durante entre 3,01 e 17 minutos de eluição. A Figura 5 mostra o perfil cromatográfico do pico A, o qual resultou na eluição de 2 frações denominadas A-1 e A-2, onde a atividade fosfolipásica foi detectada somente na fração A-1. A recromatografia do pico E também resultou na eluição de duas frações, com a atividade fosfolipásica associada à fração E-1 (Figura 6). As cromatografias de troca aniônica revelaram que ambos as frações contendo atividade fosfolipásica (A-1 e E-1) eluiram na ausência de NaCl.
FIGURA 5: Perfil cromatográfico por troca aniônica da fração A. O fracionamento foi realizado em coluna semi-preparativa Hitrap Q (16 mm x 25 mm, 1mL - Amersham Biosciences - GE), pré-equilibrada com tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8 acoplada a um sistema AKTA-FPL. A eluição foi realizada sob condições isocráticas durante os 3 primeiros minutos e então, sob gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl no mesmo tampão de equilíbrio de 3.01 a 17.00 min; após esse período até os 30 minutos, a eluiçao foi
realizada com tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8, contendo NaCl 1M. O fluxo foi de 1 mL/mim, sendo coletadas frações de 1 mL; a eluição foi monitorada a 280 nm. A
eluição das proteínas está representada pela linha contínua ( ______ ), enquanto que (o ……o) representa a atividade fosfolipásica e (---) representa o gradiente de NaCl.
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FIGURA 6: Perfil cromatográfico por troca aniônica da fração E. O fracionamento foi elaborado em coluna semi-preparativa Hitrap Q (16 mm x 25 mm, 1mL - Amersham Biosciences - GE), pré-equilibrada com tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8 acoplada a um sistema AKTA-FPL. A eluição foi realizada sob condições isocráticas durante os 3 primeiros minutos e então, sob gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl no mesmo tampão de equilíbrio de 3.01 a 17.00 min; após esse período até os 30 minutos, a eluição foi realizada com tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8, contendo NaCl 1M. O fluxo foi de 1 mL/mim, sendo coletadas frações de 1 mL; a eluição foi monitorada a 280 nm. A eluição das proteínas está representada pela linha contínua ( _____ ), enquanto que (o ……o) representa a atividade fosfolipásica e (---) representa o gradiente de NaCl.
As frações A-1 e E-1 foram submetidas à eletroforese bidimensional para avaliar a purificação das fosfolipases. O perfil eletroforético 2-D da fração A-1 está representado na Figura 7A, o qual revela que essa fração é constituída de quatro proteínas diferentes (numeradas de 1 a 4), enquanto que a Figura 7B mostra que a fração E-1 é constituída de cinco proteínas diferentes (numeradas de 5 a 9). Para a compreensão desses resultados foi necessário levantar algumas questões a respeito dos ensaios enzimáticos e dos métodos de purificação descritos anteriormente: Quão específico é o método de atividade fosfolipásica? Quão eficiente é o protocolo cromatográfico da purificação desenvolvido no presente estudo? Quais são as similaridades estruturais entre as proteínas de cada grupo (frações A-1 e E-1) no compartilhamento de algumas propriedades cromatográficas?
Capítulo 3
Nos ensaios de atividade fosfolipásica realizados no presente estudo, baseados no monitoramento espectrofotométrico da mudança de pH através da mudança de coloração do vermelho de fenol [devido à liberação de ácidos graxos durante a reação (ARAÚJO et al., 1987)], não se considera a identificação dos produtos finais formados pela digestão enzimática; apesar da detecção da atividade fosfolipásica, esse método não permite distinguir entre os tipos de catálises -A1 e -A2. Dessa forma, as proteínas das frações A-1 e E-1
que apresentam atividade fosfolipásica podem estar apresentando atividade fosfolipásica A1 ou atividade fosfolipásica A2; ou mesmo podem corresponder a
mistura de ambas as enzimas.
Em relação à eficiência do protocolo de purificação, o veneno bruto da vespa P. paulista foi também submetido à eletroforese bidimensional, corado com CBB e comparado com os perfis eletroforéticos obtidos das frações A-1 e E-1; o resultado está mostrado na Figura 8, onde é possível observar que o veneno bruto apresenta um total de 225 proteínas diferentes entre os pesos moleculares 8,5 a 102,0 KDa e pontos isoelétricos entre 3 e 10. As posições correspondentes aos spots encontrados nas frações A-1 e E-1 foram numerados de 1 a 9 neste perfil protéico, de acordo com a mesma numeração, segundo as respectivas posições observadas anteriormente nas figuras 7A e
Capítulo 3
7B. Os spots correspondentes às proteínas da fração A-1 (de 1 a 4) apresentam valores de pI entre 4,3 e 7,0, enquanto aqueles correspondentes às proteínas da fração E-1 (de 5 a 9) apresentam valores de pI de 7,7 a 9,2. Aparentemente, as fosfolipases mais ácidas eluiram primeiro (fração A) que aquelas de caráter alcalino (fração E) na cromatografia de troca catiônica mostrado na Figura 4.
FIGURA 8: Gel de Eletroforese Bidimensional 15%(v/v) do veneno bruto da vespa Polybia paulista, mostrando as nove isoformas de fosfolipases identificadas nas frações A1 e E1, oriundas do fracionamento do veneno da vespa P. paulista por cromatografia de troca aniônica. As proteínas foram focalizadas em fitas de pI de 3 a 10, com 7 cm de comprimento e a coloração realizada com CBB. Os spots enumerados de 1 a 9 representam as nove isoformas de PLA1 identificadas no veneno.
A Tabela 1 mostra os índices de purificação, os quais são bons indicadores quantitativos da eficiência desse protocolo. A atividade fosfolipásica total recuperada nas frações A-1 e E-1, em relação ao veneno bruto, foram de 30% e 12%, respectivamente. Se a atividade específica for
Capítulo 3
foram purificadas 36,5 e 9,4 vezes, respectivamente, em relação ao veneno bruto.
TABELA 1: Dados da purificação das isoformas de fosfolipase A1 e recuperação da atividade
fosfolipásica nas diferentes etapas do protocolo de purificação.
Foi necessário saber, se as proteínas presentes nas frações A-1 e E-1, representam múltiplas isoformas de um tipo específico de fosfolipases ou uma mistura de ambos os tipos da enzima (-A1, e -A2); ou mesmo, se contém uma
mistura de proteínas desconhecidas (contaminantes) e algumas fosfolipases. Para responder essas questões as frações A-1 e E1 foram submetidas a uma abordagem experimental de análise proteômica. Cada fração foi individualmente separada por eletroforese bidimensional; os perfis resultantes foram submetidos aos protocolos de eletrotransferência, onde as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF. Por sua vez, as membranas foram coradas com CBB e cada proteína foi individualmente excisada e submetida ao sequenciamento automático por Química Degradativa de Edman. As seqüências N-terminais foram utilizadas nas ferramentas de busca de para identificação de proteínas, por alinhamento básico local (BLAST). Os resultados dessa análise estão mostrados na Tabela 2, a qual mostra as proteínas com suas respectivas seqüências parciais, nome (funcional), massa molecular (KDa), ponto isoelétrico e código de acesso nos bancos de proteínas/genes. Os spots 1 e 4 foram identificados como fosfolipases A2,
Capítulo 3
enquanto os spots 2, 3, 5, 6, 7, 8 e 9 foram identificados como fosfolipases A1.
Dessa forma nota-se que a fração A-1 é constituída de uma mistura de fosfolipases A1 e A2, enquanto que a fração E-1 é constituída de uma série de
fosfolipases A1.
TABELA 2: Propriedades Proteômicas das Fosfolipases A1 e A2 do veneno da vespa social P. paulista.
As duas fosfolipases A2 identificadas na fração A-1 devem corresponder
aos monômeros das Polibitoxinas, previamente descritas nos veneno da vespa Polybia paulista como oligômeros de fosfolipases A2, apresentando níveis
elevados de açúcares neutros e uma elevada atividade hemolítica (OLIVEIRA et al., 1988).
Para caracterizar as demais isoformas, os spots 2,3,5,6,7,8 e 9 foram também submetidas ao microseqüênciamento C-terminal (Tabela 3). Todas as seqüências N- e C-terminais obtidas para as sete isoformas de fosfolipases A1
identificadas nas frações A-1 e E-1 ajustam-se perfeitamente na seqüência primária da PLA1 obtida à partir do sequencimento do cDNA, seguido de sua
tradução em seqüência de aminoácidos conforme mostrado na Figura 1; isto sugere que as PLA1s descritas acima, correspondem a diferentes isoformas da
mesma enzima precursora. Levando em consideração ambas as seqüências N- e C-Terminais mostrados na Tabela 3, é possível localizar suas posições ao longo das seqüências primárias (Figura 1), onde clivagens proteoliticas devem ter ocorrido pelas proteinases presentes no veneno em estudo. As massas moleculares hipotéticas calculadas para cada isoforma, baseadas nas posições das clivagens assinaladas na Tabela 3, são muito similares àquelas
Capítulo 3
experimentalmente determinadas pela eletroforese bidimensional, mostradas na Tabela 2.
Essa observação suporta a hipótese de que as sete isoformas de PLA1s
detectadas e identificadas no veneno da vespa Polybia paulista devem ser resultantes de ações proteolíticas em diferentes posições da seqüência primária da enzima, como mostrado na Tabela 3. Desde que o veneno foi obtido imediatamente após a coleta das vespas e extraído na presença de inibidores de proteases, a ação proteolítica não deve ser um artefato experimental, mas um processo natural, promovido pelas proteinases presentes no veneno antes da extração de veneno.
TABELA 3: Seqüências N- e C-terminais, massas moleculares hipotéticas e
localização das seqüências das sete isoformas de PLA1 do veneno da vespa P. paulista ao longo de toda seqüência primaria da enzima intacta em sua forma ativa.
A glicosilação é a modificação pós-traducional mais comum de certas proteínas intracelulares de eucariotos. Resíduos de carboidratos podem ser enzimaticamente anexados às proteínas, através da ligação N-glicosídeo via o nitrogênio amida da asparagina, ou através da ligação O-glicosídeo via a hidroxil das serinas, treoninas, hidroxilisinas ou hidroxiprolina; ou ainda, através do ancoramento de glicosilfosfatidilinositol, o qual é subsequentemente removido (STEINBERG et al., 2001). A glicosilação contribui para atividades biológicas, imunogenicidade, solubilidade, estabilidade e resistência às proteases.
Assim, a identificação de isoformas glicosiladas é um passo importante para a caracterização bioquímica das fosfolipases. Para auxiliar essa identificação, uma alíquota (50 µg) das frações A-1 e E-1 foram misturadas em proporções iguais e submetidas à eletroforese bidimensional; o perfil
Capítulo 3
eletroforético obtido foi submetido à reação com o reagente fluorescente Pro-Q Emerald 300. O conjugado fluorescente foi visualizado por fotodocumentação do gel a 300 nm.
A Figura 9 mostra o resultado desse experimento, onde são visualizados os spots 2, 4, 5 e 6, os quais correspondem a proteínas que apresentam carboidratos anexados a elas. Esse resultado também está representado na Tabela 2, revelando que o spot 4 corresponde à uma fosfolipase A2, enquanto
que os spots 2, 5 e 6 correspondem à isoformas de fosfolipase A1. A introdução
de carboidratos nas estruturas das proteínas parece ser relativamente comum entre as toxinas de vespas, assim como PLA2 dos venenos das vespas Polybia
paulista e Agelaia pallipes pallipes, e as PLA1 do veneno da formiga do gênero
Solenopsis, previamente descritos como sendo de natureza glicoprotéica (OLIVEIRA et al., 1998; COSTA et al., 2000; HOFFMAN et al., 2006); esse fato parece estar coerente com os resultados descritos acima para ambas as enzimas.
Capítulo 3
Desde que o veneno de vespas sociais é frequentemente associado a reações imunológicas, a imunoreatividade à IgE-específica foi avaliada ao quando a mistura das frações A-1 e E-1 foram submetidas à ensaios de imunodetecção com o soro de pacientes sensibilizados pelo veneno da vespa Polybia paulista. A Figura 10 mostra um resultado típico dessa caracterização biológica, onde os spots 2, 5 e 9 correspondem à proteínas imunoreativas ao soro de pacientes sensíveis ao veneno da vespa P. paulista .
FIGURA 10: Imunodetecção da mistura das frações A -1 e E-1 com os soros dos pacientes sensíveis ao veneno da vespa P.paulista.
Esses resultados também estão descritos na Tabela 4, onde as proteínas imunogênicas correspondem a diferentes isoformas de fosfolipases A1.
Capítulo 3
Tabela 4: Propriedades glicoprotéicas e imunológicas das isoformas de PLA1
do veneno da P.paulista.
Uma observação cuidadosa da Tabela 4 revela também que, as isoformas 2 e 5 da Fosfolipase A1 apresentam carboidratos anexados a elas.
Considerando que essas isoformas compartilham longas seqüências em comum com outras isoformas não imunogênicas, esse resultado sugere que os carboidratos anexados às isoformas 2 e 5 poderiam estar determinando a imunogenicidade com as IgEs específicas. No entanto, os IgEs-específicos contra os epítopos de carboidratos são considerados de baixa importânica clínica (HERMMER et al., 2004). Desta maneira, se os epítopos de carboidratos são ou não importantes para a imunogenicidade das PLA1, e se os
mesmos são muito ou pouco importantes sob o ponto de vista clínico, ainda está por ser determinado em futuras investigações.
As fosfolipases A1/A2 do veneno de vespas são descritas na literatura
como apresentando ações inflamatórias ao redor dos locais das ferroadas (KING et al., 2003); essas enzimas também são responsáveis por danos em tecidos após um acidente com múltiplas ferroadas (SCHMIDT, 1986) e algumas vezes, elas são descritas como imunoreativas à IgE-específica (KING et al., 2003; ASLAM et al., 2006). O elevado número de isoformas para a fosfolipase A1 naturalmente produzida pelo inseto, pode ser uma estratégia utilizada, para
que durante os envenenamentos, se possa atribuir à mesma enzima diferentes funções, tais como: a difusão do veneno, inflamação, lesões de tecidos e imunoreatividade à IgE-específica. Este mecanismo parece se basear em modificações pós-traducionais ocorridas sobre a forma ativa da enzima intacta,
Capítulo 3
Considerando-se a ocorrência de um elevado número de reações alérgicas após ferroadas causadas pelas vespas sociais no Brasil (ESHER et al., 2001), especialmente aquelas causadas pela Polybia paulista (OLIVEIRA et al., 1998), e a necessidade de imunoterapia dos pacientes alérgicos com extratos de venenos brutos ou proteínas puras ou recombinantes do veneno, a identificação e a caracterização molecular das proteínas imunogênicas dos venenos de vespas sociais é muito importante. Esse tipo de investigação contribui para aprofundar o conhecimento bioquímico sobre esses alérgenos, os quais ajudarão a explicar a ocorrência da reatividade cruzada entre os