As várias funções desenvolvidas pela neurofibromina e sua participação em
diferentes vias de sinalização celular sugerem que outras proteínas contribuem para a
variabilidade fenotípica observada em pacientes com NF1. A identificação desses parceiros
moleculares da neurofibromina na patogênese da doença não é simples, considerando as
características da NF1, com envolvimento de diferentes tecidos e sistemas. Muitas
abordagens já foram utilizadas para avaliação das diferenças entre células normais e
alteradas ou entre indivíduos saudáveis e aqueles exibindo diferentes graus de expressão de
uma doença. Muitas dessas tecnologias analisam a expressão gênica, como os arrays de
cDNA (DERISI et al., 1996), a hibridização subtrativa (JIANG et al., 2000), as análises
seriadas de expressão gênica (VELCULESCU et al., 1995) e outras. Um método
alternativo para avaliar essas diferenças é o estudo do produto protéico do genoma, o
proteoma. O estudo do proteoma permite compreender a estrutura e a função das proteínas
expressas pelo genoma, buscando assim o delianeamento das redes de sinalização e a
regulação da função celular normal (WILKINS et al., 1996). Estas informações podem
auxiliar na compreensão dos mecanismos associados à doença e na identificação de alvos
terapêuticos.
Uma das vantagens da abordagem proteômica é a possibilidade de detecção de
eventos pós-traducionais incluindo aqueles referentes a modificações, localização celular e
estabilidade de proteínas. Dentre as principais modificações pós-traducionais identificáveis
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ubiqüitinação e a sulfatação, que são importantes na determinação da função protéica.
Além disso, é uma metodologia muito sensível para identificar e caracterizar o
complemento protéico inteiro expresso em uma determinada condição ou momento. Em
conseqüência, seus resultados dependem de idade, sexo, estado nutricional, estilo de vida,
medicação e várias outras condições fisiológicas e patológicas do organismo e mostram
diferenças inter-individuais (PANDEY; MANN, 2000).
As técnicas proteômicas mais amplamente utilizadas compreendem a eletroforese
bidimensional (2D) e a espectrometria de massa. A eletroforese 2D é capaz de separar
centenas de proteínas em um único gel (O’FARREL, 1975; FEY; LARSEN, 2001). Essa
técnica foi descrita em 1975 e, recebeu, ao longo dos anos, inúmeras modificações que
permitiram a obtenção de mapas bidimensionais com alta resolução e reprodutibilidade,
tornando sua aplicação mais abrangente. Suas principais desvantagens referem-se à
dificuldade de detecção de certos tipos de proteínas, como as de baixa abundância
(proteínas receptoras, transdutoras de sinais e regulatórias), as muito básicas e
hidrofóbicas, as de membrana (que correspondem a 30% das proteínas totais) e aquelas
acima de 150 kDa ou abaixo de 10 kDa (NILSSON; DAVIDSSON, 2000; FEY; LARSEN,
2001). Entre essas, as de baixa abundância constituem os biomarcadores mais importantes
para estudo porque elas são reguladoras de processos celulares e provavelmente estão
relacionadas à causalidade de uma doença ou condição biológica de interesse.
A espectrometria de massa é uma técnica muito sensível e específica que permite a
identificação de proteínas e o processamento de muitas amostras simultaneamente (GYGI;
AEBERSOLD, 2000; LAHM; LANGEN, 2000; PANDEY; MANN, 2000; YATES, 2000).
O requisito básico para essa metodologia é a formação de íons livres em fase gasosa. As
proteínas ou peptídeos obtidos por digestão podem, por exemplo, ser ionizados por
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quando em meio sólido. Os íons, positivos ou negativos, são acelerados em direção ao
analisador de massa que os separa de acordo com sua relação massa-carga. Um tipo de
analisador, o time of flight (TOF), mede o tempo gasto pelos íons para viajarem da fonte ao
detector (KARAS; HILLENKAMP, 1988; FENN et al., 1989; JAMES, 1997; BANKS et
al., 2000). Esse último transforma a corrente de íons em sinais elétricos, que
posteriormente são processados e analisados por modernos sistemas de computadores
operados por usuários (PALMA et al., 2003). Esses sinais, representando peptídeos, são
comparados com massas peptídicas preditas de digestão teórica de seqüências protéicas em
banco de dados, permitindo assim que a proteína seja identificada (BANKS et al., 2000).
Além dessas duas técnicas clássicas empregadas em proteômica, outras foram
desenvolvidas e têm sido utilizadas, dentre elas a eletroforese em gel diferencial - DIGE
(UNLU et al., 1997; ZHOU et al., 2002), a isotope-coded affinity tags – ICATs (GYGI et
al., 1999), a eletroforese 2D ‘blue- native’ – 2D BN-PAGE (BROOKES et al., 2002), a
separação de proteínas tridimensional – 3D (WALL et al., 2002), a surface-enhaced laser
desortion/ionization – SELDI (WRIGHT et al., 2002; ISAAQ et al., 2003; PETRICOIN;
LIOTTA, 2004), a técnica de identificação de proteínas multidimensional – MudPIT ou
proteômica shotgun (LINK et al., 1999; WASHBURN et al., 2001, WOLTERS et al.,
2001; PAOLETTI et al., 2004), o sistema di-híbrido de levedura - Y2H (FIELDS; SONG,
1989; BUCKHOLZ et al., 1999; LEGRAIN; SELIG, 2000; UETZ et al., 2000; GAVIN et
al., 2002; HO et al., 2002) e os arrays de proteínas (EMILI; CAGNEY, 2000; WALTER et
al., 2000; SREEKUMAR; CHINNAIYAN, 2002).
Abordagem proteômica oferece a possibilidade de identificação de padrões
bioquímicos e de marcadores protéicos que podem auxiliar no diagnóstico ou no
prognóstico de doenças e na seleção de alvos potenciais para terapia (CHAMBERS et al.,
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de muitas doenças, processos biológicos, efeito de fatores externos ou agentes patogênicos
(Tabelas 1 e 2).
Apesar do grande número de estudos empregando técnicas proteômicas em várias
doenças humanas, há somente um trabalho publicado sobre Neurofibromatose Tipo 1
(DASGUPTA et al., 2005), cujo objetivo foi identificar vias de sinalização intracelular
adicionais em astrócitos Nf1-deficientes.
Pelo exposto acima e diante da escassez de trabalhos que empregam tecnologias
proteômicas em NF1, fica evidente que essa abordagem pode fornecer informações
relevantes para o esclarecimento de mecanismos de patogênese envolvidos na
neurofibromatose e auxiliar na identificação de parceiros moleculares em vias de
sinalização celular das quais a neurofibromina participa. Além disso, também tem
potencial para a identificação de alvos terapêuticos que auxiliem no controle do curso da
doença.
Os objetivos do presente trabalho foram:
1. Implantar, no laboratório, a técnica de eletroforese bidimensional para análise do
perfil protéico de amostras biológicas.
2. Utilizando abordagem proteômica, investigar proteínas com padrão de expressão
diferencial em neurofibromas e margens cirúrgicas histologicamente normais (pele normal)
de pacientes com Neurofibromatose Tipo 1.
3. Investigar o papel potencial das proteínas identificadas e dos processos celulares
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Tabela 1. Tipos de câncer avaliados por abordagem proteômica.
Câncer Referências Câncer Referências
cabeça e pescoço WU et al ., 2002 MELLE et al., 2003 SIDRANSKY et al., 2003 CHEN et al., 2004 HE et al., 2004
WADSWORTH et al., 2004a WADSWORTH et al., 2004b
esôfago SOLDES et al., 1999 PAWELETZ et al., 2000 ZHOU et al., 2002 ZHANG et al., 2003
colorretal STULIK et al., 1997 STULIK et al., 1999a STULIK et al., 1999b STULIK et al., 2001 YU et al., 2004 MELLE et al., 2005
bexiga CELIS et al., 1996a CELIS et al., 1996b OSTERGAARD et al., 1997 CELIS et al., 1999 OSTERGAARD et al., 1999 CELIS et al., 2000 VLAHOU et al., 2001 IWAKI et al., 2004 cólon TACHIBANA et al., 2003
ALBRETHSEN et al., 2005
estômago HA et al., 2002 RYU et al., 2003 pulmão OKUZAWA et al., 1994
CHEN et al., 2002 HOWARD et al., 2003 LI et al., 2003
XIAO et al., 2003-2004 ZHUKOV et al., 2003
ovário ALAIYA et al., 1997 ALAIYA et al., 1999 JONES et al., 2002 PETRICOIN et al., 2002a BANDERA et al., 2003 KOZAK et al., 2003 YE et al., 2003 AHMED et al., 2004 ZHANG et al., 2004 mama FRANZEN et al., 1996a
FRANZEN et al., 1996b BINI et al., 1997 CZERWENKA et al., 2001 HONDERMARCK et al., 2001 PAWELETZ et al., 2001 VERCOUTTER-EDOUART et al., 2001 WULFKUHLE et al., 2001 LI et al., 2002 KUERER et al., 2002 SAUTER et al., 2002 WULFKUHLE et al., 2002 DWEK; ALAIYA, 2003 RUI et al., 2003 SOMIARI et al., 2003 VARNUM et al., 2003 BISCA et al., 2004 CELIS et al., 2004 LARONGA et al., 2003-2004 PUSZTZAI et al., 2004
próstata GROVER; RESNICK, 1995 GROVER; RESNICK, 1997 ORNSTEIN et al., 2000 PAWELETZ et al., 2000 ALAIYA et al., 2001 CHARRIER et al., 2001 AHRAM et al., 2002 ADAM et al., 2002 CAZARES et al., 2002 MEEHAN et al., 2002 PETRICOIN et al., 2002b QU et al., 2002 BANEZ et al., 2003 HLAVATY et al., 2003 LEHRER et al., 2003 ZHENG et al., 2003 LIU et al., 2005
pâncreas ROSTY et al., 2002 KOOPMANN et al., 2004
fígado KIM et al., 2002 POON et al., 2003 STEEL et al., 2003 YOKOYAMA et al., 2004 BLOCK et al., 2005 rim SARTO et al., 1997
BALABANOV et al., 2001 ROGERS et al., 2003
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Tabela 2. Doenças, organismos e processos biológicos avaliados por abordagem
proteômica.
Objeto de estudo Referências
Doenças neurológicas
Alzheimer EDGAR et al., 1999
TSUJI et al., 1999 UENO et al., 2000 HESSE et al., 2001 SCHONBERGER et al., 2001 CASTEGNA et al., 2002 KOROLAINEN et al., 2002 CARRETE et al., 2003 KANNINEN et al., 2004 doença de Creutzfeldt-Jakob LEE; HARRINGTON, 1997
GUILLAUME et al., 2003 esquizofrenia HARRINGTON et al., 1985
EDGAR et al., 1999 EDGAR et al., 2000 esclerose múltipla WIEDERKEHR et al., 1986
WHEELER et al., 1987 DUMONT et al., 2004 Doenças cardíacas
cardiomiopatia dilatada BAKER et al., 1992 JUNGBLUT et al., 1992 LATIF et al., 1993 KNECHT et al., 1994 PLEISSNER et al., 1997 POHLNER et al., 1997 CORBETT et al., 1998 WEEKES et al., 1999 hipertrofia cardíaca ou doenças similares ARNOTT et al., 1998 HEINKE et al., 1998 HEINKE et al., 1999
Diabetes ANDERSEN et al., 1995
LARSEN et al., 2001
Leucemia KEIM et al., 1992
MELHEM et al., 1997 VOSS et al., 2001 Erros inatos do metabolismo CLAYTON, 2001
Apoptose ROBAYE et al., 1994
MAXWELL et al., 1996 MULLER et al., 1999 Microrganismos patogênicos MCATTE et al., 1998a
MCATEE et al., 1998b WELDINGH et al., 1998 CASH et al., 1999 TOBISCH et al., 1999 ANTELMANN et al., 2000 DE BACKER et al., 2000 JUNGBLUT et al., 2000 SVENSATER et al., 2000 ANTELMANN et al., 2002 EYMANN et al., 2002 FLORENS et al., 2002 cont.
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HAAS et al., 2002 LASONDER et al., 2002 NILSSON, 2002 REID et al., 2002 Efeitos toxicológicos STEINER et al., 1996a
STEINER et al., 1996b AICHER et al., 1998 CUTLER et al., 1999 WITZMANN et al., 1999 MÖLLER et al., 2001 cont.