4. Methodology and Methods
4.2 The Research Process
Os micro-organismos são excelentes fontes de novas moléculas, as quais podem ter aplicabilidade como protótipo nas áreas farmacêutica, agroquímica, alimentícia e cosmética. O metabolismo secundário fúngico é estruturalmente bastante diversificado e sua função baseia-se, principalmente, na autodefesa contra outros micro-organismos, uma vez que, o seu habitat natural
22
os levas a desafios ecológicos pela condição dinâmica que o ambiente lhes oferece (SHWAB e KELLER 2008, SUN et al., 2011).
Micro-organismos endofíticos representam um significante reservatório de diversidade genética e uma fonte importante para a descoberta de novos metabólitos secundários bioativos. Inúmeros e importantes metabólitos descritos na literatura são produzidos por estes organismos. Entre estes, destacam-se agentes anticancerígenos, imunossupressivos, antiparasitários, antibióticos, entre outros (GUNATILAKA, 2006). As interações entre o fungo e o meio ambiente refletem no aumento da produção de seus metabólitos. Dessa forma, os fungos endofíticos são uma fonte importante para a descoberta de novos metabólitos secundários bioativos, uma vez que crescem nos tecidos internos de plantas e seu crescimento envolve continua interação metabólica entre os organismos.
Uma estratégia inicial traçada para a exploração do metabolismo fúngico, e consequente, busca de novos compostos, consistia em isolar um amplo número de fungos dos mais variados ambientes como florestas tropicais, desertos, áreas glaciais e/ou isolar estes micro-organismos de diversas fontes, tais como plantas, líquens, insetos, dentre outros. No entanto, estudos recentes mostraram que os micro-organismos possuem um potencial genético inexplorado para a produção de metabólitos secundários, uma vez que, em condições padronizadas de cultivo muitos desses genes estão “silenciados” (SCHERLACH e HERTWECK, 2009).
BODE et al. (2002) propuseram a abordagem denominada OSMAC (One Strain Many Compounds), na qual uma única cepa de micro-organismo é capaz de produzir uma infinidade de compostos. Esta abordagem consiste em mimetizar o meio ambiente, através de modificações nas condições de cultivo, sejam elas bióticas ou abióticas.
O fator biótico baseia-se nas interações entre os micro-organismos no meio ambiente, as quais estão relacionadas à competição por espaço e
23
nutrientes e que está diretamente envolvida na indução de metabólitos secundários. Desta forma, o cultivo de um ou mais micro-organismos no mesmo frasco fermentativo, pode levar a produção de novos metabólitos que não eram previamente observados nas culturas individuais de cada micro-organismo (SCHERLACH e HERTWECK, 2009). Recentemente, OLA et al. (2013) mostraram a influência da bactéria Bacillus subtilis 168 trpC2 no metabolismo de Fusarium tricinctum. A interação entre ambos levou a um incremento nos metabólitos já produzidos pelo fungo, além da produção de três novos compostos, macrocaporna C, N-(carboximetil) ácido antranílico e citreoisocumarinol, conforme pode ser visto na FIGURA 1.12. Os autores mostraram que a produção destas substâncias ocorre de forma específica, uma vez que, o co-cultivo do fungo com Streptomyces lividans não promoveu a produção dos compostos mencionados.
Os fatores abióticos estão relacionados a modificações química e/ou físicas do meio de cultura. As modificações referentes aos parâmetros físicos relacionam-se com a temperatura, aeração e a incidência luminosa (MIAO, 2006) já, dentre os parâmetros químicos podem-se citar a variação da concentração de fontes de carbono e nitrogênio, a alteração de pH, salinidade (GOGOI et al., 2008, HUANG, et al., 2001) e a adição de precursores e inibidores da biossíntese de metabólitos de interesse (CHRISTIAN et al., 2005).
Alteração do meio de cultura através da suplementação de diferentes fontes de carbono pode promover um incremento na diversidade química, uma vez que, este elemento é a principal fonte de energia. Recentemente, foi relatada a produção de nafto-γ-pironas diméricas pelo fungo Aspergillus tubingensis em meio BD (batata-dextrose) (HUANG et al., 2010), no entanto, quando o micro-organismo foi cultivado em arroz foram isoladas quatro novas estruturas desta classe de compostos, rubasperona D, rubasperona E, rubasperona F e a rubasperona G, conforme mostra a FIGURA 1.12 (HUANG et al., 2011).
24
A fonte de nitrogênio é outro fator importante na produção de metabólitos secundários. Os micro-organismos são capazes de utilizar uma grande quantidade de compostos orgânicos e inorgânicos, bem como misturas complexas, como peptonas, extratos de soja, levedura como fonte de nitrogênio, para produzir as proteínas que são necessárias ao seu desenvolvimento e também na biossíntese do metabolismo secundário. XIAOBO e colaboradores (2006) demonstraram que altas concentrações de extrato de levedura (composto por vitaminas, aminoácidos, lipídeos, e outras substâncias) prejudicaram o desenvolvimento fúngico e, por sua vez, suprimiu a biossíntese de metabólitos secundários. Em contrapartida, alguns pesquisadores relatam que meios de cultura contendo altas concentrações de extrato de levedura ou extrato de malte, suplementados com minerais e quantidades traço de metais, geralmente, levam a um incremento na variedade e na produção de produtos naturais (FRISVAD et al., 2008). ARAI et al. (2012) verificaram a resposta de Penicillium sp. AZ, produtor do pigmento PP-V (FIG. 1.12), frente à variação de compostos nitrogenados. Os experimentos mostraram que o íon amônio é mais eficiente na produção do pigmento quanto comparado ao nitrato, no entanto, o extrato de levedura não levou a produção da substância.
WANG e colaboradores (2014) cultivaram o fungo marinho Ascotricha sp. em meio Czapek, porém substituindo o sal MgSO4 por MgCl2,
além disso, verificaram a influência da concentração do sal no metabolismo secundário fúngico. Os pesquisadores mostraram que a aplicação da abordagem OSMAC promoveu o aumento da diversidade química microbiana, uma vez que, além dos metabólitos já conhecidos, o micro-organismo produziu, em baixas concentrações do sal, três novos sesquiterpenos cariofilenos, 6-O-desmetil pestalotiopsina A, 6-O-desmetil pestalotiopsina C e 6-O-desmetil pestalotiopsina B, conforme ilustra a FIGURA 1.12. Este foi o primeiro relato da produção desta classe de compostos por fungo do gênero Ascotricha, sendo que análogos
25
destas substâncias são comumente isolados dos fungos Humicola fuscoatra, Pestalotiopsis sp. e Cytospora sp..
A abordagem OSMAC representa uma ferramenta de extrema utilidade para elucidar o metaboloma dos diversos micro-organismos, ou seja, detecção e identificação dos metabólitos secundários produzidos por um determinado organismo (BODE et al.,2002). Embora uma alteração sistemática nos parâmetros de cultivo possa ser aplicada para linhagens selecionadas, a abordagem OSMAC é aleatória e não permite o desenvolvimento de uma regra comum para todos os micro-organismos, uma vez que, cada um terá uma resposta particular definida pelo seu genoma (BODE, et al., 2002). O objetivo subseqüente da OSMAC está relacionado com a identificação dos genes responsáveis pela indução ou alteração do padrão metabólico, cuja meta seria a avaliação e determinação de quais compostos de um determinado meio de cultivo seriam responsáveis pela indução da biossíntese de metabólitos desconhecidos (BODE et al.,2002).
26
A característica aleatória da abordagem OSMAC para despertar a biossíntese de novos produtos naturais é fortemente dependente de se encontrar as condições ideais para que os genes silenciados sejam expressos em laboratório. Recentemente, técnicas modernas de gênomica, regulação gênica, bio-informática e epigenética vêm sendo utilizadas para se compreender e promover a expressão destes genes.