The market analysis

As análises de expressão diferencial entre os grupos de carne macia e dura revelaram 40 genes diferencialmente expressos (DE) (qvalue<0,05) (Tabela 4). Dentre eles, 17 possuem função descrita.

O sinal do log2 (fold change), referente à expressão relativa, foi usado

para caracterizar os genes em reprimidos (down regulated) ou induzidos (up regulated), sendo que, nesta análise, foram encontrados 35 genes induzidos e 5 reprimidos em relação ao grupo de carne macia. Dentre os genes que possuem função descrita, 14 são induzidos e 3 reprimidos.

Tabela 4: Genes diferencialmente expressos encontrados nas amostras

divergentes para maciez da carne. Símbolo do gene diferencialmente expressos (Gene), localização do gene no genoma Bos taurus, valores de FPKM obtidos para carne macia e dura (Macia e Dura, respectivamente), expressão relativa (log2(fold change)), p-valor e q-valor.

Gene Locus Macia Dura _{(fold change)*} log2 p valor q valor

ASAH1 27:18312322-18314792 0,924241 0,265766 179,811 0,0001 0,0136 AT2 X:1024840-1027901 112,057 0,163197 277,955 0,0001 0,0078 BOLA-DQB 23:25855145-25863052 122,213 682,692 -0,840093 0,0001 0,0078 CLDN19 3:104091609-104096449 112,997 0,133369 308,279 0,0001 0,0078 CLEC12A 5:100388588-100401353 205,909 0,31943 268,844 0,0001 0,0078 CLEC4G 7:17785971-17789026 213,916 0,152397 381,114 0,0002 0,0251 CTNNB1 22:13897328-13898816 129,849 0,179967 285,103 0,0001 0,0078 DMGDH 10:9994009-10066954 0,700546 0,0710559 330,145 0,0001 0,0078 EXOSC2 11:101010350-101010501 146,306 109,334 374,217 0,0001 0,0078 HMOX1 5:73980699-73987841 115,512 197,874 -0,776539 0,0002 0,0251 IQCG 1:70792451-70838105 0,975199 0,0683124 383,548 0,0001 0,0078 PCP4L1 3:8249980-8276724 179,755 0,413335 2,120 0,0001 0,0078 PNP 6:87555287-87556157 163,788 543,206 -159,226 0,0001 0,0078 SYP X:92308615-92320415 0,814972 0,169198 226,804 0,0001 0,0078 TCF7L1 11:49714024-49715693 931,924 299,392 163,818 0,0001 0,0078 USP32 19:13087794-13088565 293,099 0,401415 286,822 0,0001 0,0078 ZKSCAN2 25:23091496-23104117 0,689172 0,130967 239,566 0,0001 0,0078 ENSBTAG00000022947 21:21965065-21966315 156,027 0,257492 25,992 0,0001 0,0078 LOC511981 14:58850047-58851086 300,014 108,315 14,698 0,0001 0,0136 XLOC_001046 1:150301045-150303606 0,781722 0,211096 188,876 0,0001 0,0136 XLOC_001185 1:91928092-91930927 0,775044 0,232207 173,887 0,0001 0,0078 XLOC_001280 1:151442513-151443449 221,613 0,163023 37,649 0,0001 0,0078 XLOC_002455 10:2270299-2271226 213,386 0,108797 429,375 0,0001 0,0078 XLOC_002491 10:20795303-20795839 49,187 0,291183 407,828 0,0001 0,0078 XLOC_002519 10:28447880-28449134 173,421 0,402111 210,862 0,0001 0,0136 XLOC_004829 13:42396473-42396753 241,093 676,471 -183,349 0,0001 0,0078 XLOC_005750 13:67915346-67916938 222,208 0,0434508 567,638 0,0001 0,0078 XLOC_006476 14:27940730-27941920 173,549 0,233603 289,322 0,0001 0,0078 XLOC_014455 21:61587088-61588096 194,026 0,110438 413,493 0,0001 0,0078 XLOC_018808 28:17838746-17847124 120,255 0,353753 176,528 0,0001 0,0136 XLOC_021066 3:20773659-20775848 100,205 0,252969 198,593 0,0001 0,0078 XLOC_022736 4:59964007-59966831 0,820647 0,270615 160,052 0,0002 0,0198 XLOC_022836 4:114608102-114609417 166,248 0,334759 231,214 0,0001 0,0078 XLOC_022848 4:115985386-115986391 206,906 0,302608 277,346 0,0001 0,0078 XLOC_022865 4:119488532-119490812 0,857893 0,171544 232,222 0,0001 0,0078

Continuação XLOC_024373 5:47857813-47858488 368,063 0,591044 263,861 0,0001 0,0078 XLOC_028948 9:32650968-32653108 0,903283 0,135688 273,489 0,0001 0,0078 XLOC_029021 9:76153645-76154023 105,826 23,362 217,945 0,0001 0,0078 XLOC_029070 9:102893791-102894054 21,503 101,088 -441,086 0,0001 0,0078 XLOC_029184 GJ060137.1:2576-3597 194,018 0,224785 310,957 0,0001 0,0078

* as estimativas de fold change (expressão relativa) são referentes ao grupo com carne macia.

Uma análise de anotação funcional conjunta utilizando todos os genes diferencialmente expressos (induzidos e reprimidos) anotados para maciez da carne foi realizada por meio da base de dados David v6.7 (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) utilizando Bos Taurus como referência. Com esta análise foram identificados sete grupos funcionais (“Annotation clusters” - Anexo 1). Estes genes foram classificados de acordo com sua função em: fração celular (GO:000267), junção celular (GO: 0030054), intrínseco à membrana (GO: 0031224), regulação da comunicação celular (GO: 0010646), atividades catalíticas (GO: 0003824), organelas (GO: 0043226), binding (GO: 0005488), entre outros.

As categorias funcionais junção celular, regulação da comunicação celular e intrínseco à membrana estão relacionados à ligação, comunicação e transporte de moléculas entre as células (CARBON et al., 2009).

Dentre os transcritos relacionados nessas categorias, o CTNNB1(Catenin - Cadherin-Associated Protein Beta 1), mais expresso em carne macia, está envolvido na mesma via metabólica das proteínas actina e miosina. A actina e miosina são as proteínas formadoras dos miofilamentos finos e grossos, respectivamente, que constituem a miofibrila, organela cuja função é a contração muscular. Essas proteínas são as mais abundantes no mecanismo de contração

do músculo e representam 52 a 56 % das proteínas musculares (SGARBIERI, 1996).

Cada filamento de actina se liga à membrana plasmática da célula por meio de uma estrutura chamada contato focal, formada por proteínas ligadoras e pela proteína transmembrana, que são produtos da via metabólica “Adesão focal”, da qual os genes CTNNB1 e TCF7L1 (transcription factor 7 like 1) fazem parte. Pelo lado externo da célula, na matriz extracelular, a proteína transmembrana se liga a uma fibra de colágeno (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2005; DE ROBERTIS 2010), e segundo Bailey (1998), há uma ligação direta entre o conteúdo de colágeno e o endurecimento da carne. Apesar disso, neste trabalho, os transcritos CTNNB1 e TCF7L1 foram mais expressos em carne macia.

O transcrito SYP (Sinaptofisina), mais expresso em carne macia, codifica uma proteína integral de membrana presente em pequenas vesículas sinápticas. Segundo Rubenstein et al. (1996), em estudos com ratos, a sinaptofisina é cálcio dependente, e quando na presença do complexo calmodolina-cálcio, há um aumento de quatro vezes na fosforilação da serina pela sinaptofisina. Segundo Bailey et al. (1998), as serinas proteases são uma das responsáveis pela degradação de colágeno, que por sua vez, influencia diretamente na maciez da carne. Além disso, o cálcio é essencial para o mecanismo de contração muscular, pois atua como catalisador na atividade proteolítica enzimática que está diretamente relacionado ao processo de amaciamento da carne (OUALI, et al. 2013).

O transcrito CLDN19, mais expresso em carne macia, codifica proteínas transmembranas presentes nas junções apertadas ou ocludentes (tight

junctions) das células (KANEHISA e GOTO, 2010; KANEHISA, et al. 2016). As junções ocludentes controlam a passagem de íons, proteínas e lipídios entre os domínios apical e basolateral de células epiteliais. A facilitação da difusão de eletrólitos diminui a coesividade das miofibrilas e causa a diminuição do pH muscular (LEE et al., 2006).

O transcrito AT2 que codifica a proteína angiotensina II, mais expresso em carne macia, tem função de vasoconstrição e regula a secreção da aldosterona, que por sua vez leva à reabsorção de sódio pelos rins. Dessa forma, após o abate, durante a sangria, a angiotensina entra em ação para restaurar a pressão arterial. O resultado desses estímulos é a despolarização da membrana celular, alterando a distribuição do sódio e do potássio, além de permitir um fluxo de íons cálcio (RUBENSAM, 2000). Em estudo com bovinos cruzados (Luxi-Simental), foi observado queda na força de cisalhamento após injetarem solução de angiotensina 2 nas carcaças durante 7 dias após o abate (ZHONG-LIANG, et al., 2009). Bongiorni et al. (2016) estudando a expressão gênica no músculo Longissimus dorsi em bovinos das raças italianas Maremmana e Chianina, extremos pra maciez da carne, também encontraram genes diferencialmente expressos relacionados ao fluxo de sódio e potássio.

A categoria funcional “atividade catalítica” está relacionada ao aumento da velocidade de uma reação bioquímica em temperaturas fisiológicas (CARBON et al., 2009). Algumas reações que ocorrem no período post-mortem são dependentes do íon cálcio e do pH celular que decresce nas primeiras 24 horas após o abate (KOOHMARAIE, 1995).

Um membro dessa categoria funcional, é o ASAH1 (N-Acylsphingosine Amidohydrolase (Acid Ceramidase) 1), que faz parte de uma família de

hidrolases que catalisam e degradam as ceramidas em espingolipidios e um ácido graxo livre e são pH ácido dependentes (LUCKI et al, 2011). A deficiência genética na atividade catalítica da ASAH1 ocasiona uma desordem no armazenamento lisossômico de esfingolipídios, que leva ao acumulo de lipídios em células e tecidos de todo o organismo (PARK et al., 2006). O ASAH1 também pertence a vias metabólicas como “via de sinalização dos esfingolipídios” e “metabolismo de espingolipídios”, nas quais a serina também atua, sendo que a serina protease degrada colágeno (BAILEY et al, 1998). Dessa forma, ASAH1 mais expresso em carne macia, pode estar relacionado ao processo de amaciamento da carne.

Outro membro presente na categoria funcional “atividade catalítica”, o transcrito HMOX1(Heme Oxygenase 1), mais expresso em carne dura, codifica uma proteína que está relacionada ao metabolismo das porfirinas, moléculas que possuem atividade catalítica ativada por ferro (MANSO et al., 1999), e são percursoras das hemes, que por sua vez, são os principais componentes das hemoglobinas, mioglobinas e citocromos. Essas moléculas são as responsáveis pelo transporte de oxigênio e elétrons nos tecidos (OTTERBEIN et al., 2003).

A família CLEC corresponde a uma subunidade da lectina tipo C (dependente de cálcio para ligação) que atua ligando domínios de proteínas a carboidratos e no processo de adesão célula-célula (DRICKAMER, 1999). Neste trabalho, os transcritos CLEC4G e CLEC12A foram mais expressos em carne macia. Estudo de GWAS (estudo de associação genômica ampla) com bovinos Nelore encontrou associação do gene CLEC12A com diferentes medidas de maciez (TIZIOTO et al. 2013).

Dentre os transcritos diferencialmente expressos, o HMOX1, AT2, CLDN19, CLEC4G, CLEC12A e SYP, estão inter-relacionados por meio de processos biológicos (comunicação celular, regulação da resposta a estímulos), função molecular (proteínas de ligação) ou componentes celulares (componente integral da membrana) (FIGURA 4). As proteínas codificadas por estes transcritos estão envolvidas no mecanismo de transporte de moléculas como sódio, potássio, cálcio e oxigênio (DRICKAMER, 1999; RUBENSAM, 2000; OTTERBEIN, et al.,2003; LEE et al., 2006).

Figura 4: Análise de enriquecimento dos genes HMOX1,CLDN19, CLEC4G, CLEC12A, PNP e SYP realizada por meio do pacote ClueGO do

O transcrito IQCG (IQ motif containing G), mais expresso em carne macia, codifica uma proteína que funciona como local de ligação para diversas proteínas, incluindo as cadeias leves de miosinas e as calmodulinas. A calmodulina fosforila a miosina, ocasionando o deslizamento das fibras e contração do músculo. Neste caso, o cálcio presente na reação, se liga às calmodulinas, unidas ao IQ motif, e estimula a atividade ATPásica da miosina (RHOADS, 1997). Segundo Duston, 1976, entre outros fatores como conteúdo de colágeno, a estrutura e estado da contração de miofibrilas (compostas principalmente de miosina e actina), afetam diretamente a maciez da carne.

O produto do gene PCP4L1 (Purkinje cell protein 4 like 1) é caracterizado pela presença do domínio IQ. Estudo de GWAS revela que este gene está relacionado à gordura visceral em humanos (FOX et al., 2012).

A proteína codificada pelo transcrito PNP (purina nucleosídeo fosforilase), mais expresso em carne dura, atua no metabolismo do nicotinate e da nicotinamida. O nicotinate (niacina ou vitamina B3) é precursor da coenzima NAD+ e NADP+ que são essenciais na formação de ATP na célula (LAMP, 2015). Inúmeras mudanças estruturais e eventos bioquímicos ocorrem nas primeiras 24 horas após o abate dos animais e é neste período que o músculo se converte em carne (KOOHMARAIE, 1995).

Nos primeiros momentos post-mortem, devido à conversão de ADP mais fosfocreatina em ATP, os níveis de ATP são mantidos constantes e devido à falência sanguínea, o transporte de oxigênio deixa de funcionar. Neste momento, há uma lenta produção de lactato e inicia-se o rigor mortis (fase lenta). No entanto, com a diminuição dos níveis de fosfocreatina inicia-se a fase rápida, na qual há uma queda acelerada na quantidade de ATP disponível, que após o

consumo do glicogênio e outros carboidratos, é utilizado como reserva energética e por isso, hidrolisado novamente em ADP. Devido à escassez de ATP, esta fase é acompanhada da liberação de íons cálcio no espaço miofibrilar, o que leva ao encurtamento do músculo, influenciando diretamente a maciez da carne (BENDALL, 1973).

Neste momento também ocorre a transformação de glicogênio em glicose por meio da via anaeróbica, o que gera lactato e diminui o pH do meio. Além disso, o mecanismo de transporte de sódio e potássio através da membrana celular, que utiliza energia liberada por meio da hidrólise de ATP em ADP, passa a ser prejudicado devido a sua ocorrência ser contra o gradiente de concentração. Os prótons gerados durante a hidrólise de ATP em ADP causam significativa queda no pH intracelular (BATE-SMITH e BENDALL, 1949). Segundo Darrel, et al.(2003), a queda do pH influencia diretamente a maciez final da carne, principalmente durante o processo de maturação.

Segundo Koohmaraie et al. (1996), o cálcio é responsável pela ativação das calpaínas e calpastatinas (proteases de cisteínas dependentes de cálcio) e a calpaína I tem sido a principal responsável pelo processo de amaciamento da carne, pois degrada proteínas citoesqueléticas responsáveis pela integridade estrutural da matriz miofibrilar. Apesar disso, nesse trabalho, os genes da calpaína e calpastatina não foram diferencialmente expressos entre os grupos de carne macia e dura. Isso pode ter acontecido, pois segundo RUBENSAM et al. (2000), há uma maior quantidade de calpastatina nas células 24 horas após o abate, e neste estudo, as amostras foram coletadas logo após a toillet das carcaças. Outros trabalhos de GWAS e expressão gênica em tecido muscular de

bovinos Nelore também não encontraram relação entre a maciez da carne e a calpaína e a calpastatina (TIZIOTO et al., 2013; GONÇALVES 2015).

O transcrito EXOSC2, que codifica a proteína Componente 2 dos exossomos, foi mais expresso em carne macia. Exossomos de células endoteliais de humanos sob hipóxia podem aumentar a atividade do colágeno (JONG et. al 2015) e segundo Bailey et al. (1998), há uma ligação direta entre o conteúdo de colágeno e o endurecimento da carne.

O gene DMGDH (dimetilglicina dehidrogenase) é membro da via metabólica do “metabolismo de glicina, serina e treonina” (Figura 5). A glicina constitui cerca de um terço das cadeias polipeptídicas helicoidais que compõem o colágeno (LEHNINGER et al., 2002). Por outro lado, segundo Bailey (1998),o colágeno é degradado por serinas protease, sendo que a serina também faz parte da via das glicinas, e cisteínas proteases, que por sua vez, tem via metabólica (“metabolismo de cisteína e metionina”) relacionada à via pertencente ao gene DMGDH. No presente trabalho, o transcrito referente a esse gene, foi mais expresso em carne macia.

Figura 5: Análise de enriquecimento do gene DMGDH realizada por meio do

aplicativo ClueGO. Os círculos em amarelo destacam os processos biológicos e a via metabólica relacionados à serina e glicina, as quais este gene está envolvido.

Na Figura 6 podem ser visualizadas as interligações entre os transcritos TCF7L1, EXOSC2, DMGDH e ASAH1, geradas por meio de análise de enriquecimento. Esta análise mostra que a principal ligação entre eles é o componente celular chamado “organela intracelular de ligação à membrana”. Essa categoria é referente a estruturas encontradas dentro da célula, como núcleo, mitocôndrias, entre outros (CARBON et al., 2009). Estudo de expressão gênica com gado Angus também encontrou relação entre maciez da carne e esta categoria de componentes celulares (ZHAO et al., 2012). Os genes encontrados nesse trabalho estão relacionados às proteínas actina e miosina,

colágeno, acúmulo de lipídios e às vias metabólicas da serina e glicina (BAILEY et al. 1998; LEHNINGER et al. 2002; PARK, et. al, 2006; JONG, et. al 2015).

FIGURA 6: Análise de enriquecimento dos genes TCF71, EXOSC2, DMGDH e

ASAH1 realizada por meio do aplicativo ClueGO.

O transcrito ZKSCAN2 (“zinc finger with KRAB and SCAN domains 2”), mais expresso em carne macia, específico de vertebrados, sintetiza proteínas “zinc finger” que se ligam através de um N-terminal ao domínio SCAN (motif de dimerização). A função desse gene não é bem conhecida, no entanto, as proteínas zinc finger têm sido associadas à regulação da transcrição de fatores de crescimento e metabolismo lipídico (SANDER et al., 2003).

Em bovinos, o complexo principal de histocompatibilidade classe II é chamado de Bola-DQB (antígeno leucocitário bovino) (KLEIN et al., 1990). Neste estudo, o transcrito Bola-DQB foi mais expresso em carne dura. Não foram

encontrados estudos que associam este gene à maciez da carne, no entanto, em bovinos Holandeses e de corte (Angus, Charoles, Hereford, Limousin, Simental) este gene foi associado a características de crescimento (BATRA et al. 1989 e STEAR et al. 1989) e segundo Koohmaraie et al.(2002) e Thirkildsen et al.(2002), animais com altas taxas de crescimento apresentam carnes mais palatáveis e macias.

Neste trabalho, o transcrito USP32 (peptidade específica da ubiquitina 32), foi mais expresso em carne macia. Os membros da família ubiquitina proteossoma são importantes durante a transformação de músculo em carne, pois atuam no sistema de proteólise ocasionando a degradação das proteínas miofibrilares nas células musculares (SEKIKAWA et al.,1998). Tizioto et al. (2013), em estudo de GWAS com bovinos Nelore abordando várias mensurações para maciez da carne, encontraram genes pertencentes à família USP, dentre eles o gene USP32. Em outros estudos com bovinos, os genes da família USP também foram associados à maciez da carne. Em bovinos da raça Wagiu o gene USP2 foi fortemente associado com a característica maciez da carne (CRC, 2008) e em estudo de expressão gênica com bovinos Nelore, o gene USP2, foi mais expresso em amostras de carne macia (GONÇALVES, 2015).

Não foram encontrados genes em comum neste trabalho e em estudo de GWAS para maciez da carne com esta mesma população de bovinos Nelore, no entanto, foram encontradas funções em comum relacionadas à fosforilação e à atividade catalítica (MAGALHÃES, 2015). Tizioto et al. (2013), também em trabalho de GWAS com bovinos Nelore encontraram regiões que influenciam a maciez em 3 momentos (24 horas, 7 e14 dias após o abate). Alguns genes

encontrados por esses autores são comuns a este trabalho, como CLDN19, CLEC12A e USP32. Além desses, genes pertencentes à família dos transcritos BOLA-BQD, CTNNB1, EXOSC2, IQCG foram associados à maciez da carne segundo estes autores.

4.3.1. Validação de genes diferencialmente expressos

Os valores da expressão relativa dos transcritos (log2) foram semelhantes

nas duas técnicas empregadas, RNA-Seq e qRT-PCR, sendo 2,12 e 2,03 para o gene PCP4L1 e de -0,840 e -0,644 para o BOLA-BQD, respectivamente (Figura 7). Da mesma forma que nas análises de RNA-Seq, os genes PCP4L1 e BOLA- BQD expressaram-se mais em animais de carne macia e dura, respectivamente. Assim, estes transcritos mostraram padrões semelhantes de abundância de mRNA e mesma direção (isto é, induzido e reprimido, respectivamente em relação ao grupo de carne macia) nas análises de RNA-Seq e qRT-PCR.

Figura 7: Comparação dos valores de expressão relativa, obtidos por RNA-

Seq e qRT-PCR em dois transcritos diferencialmente expressos. -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 PCP4L1 BLA-BQD Log 2 (E xp re ssão R e lativ a) RNA-Seq qRT-PCR