As análises de Real Time PCR quantitativo foram realizadas com o objetivo principal de comprovar a atuação essencialmente no intestino médio de várias enzimas anotadas como digestivas. A comparação do perfil de expressão ao longo do desenvolvimento com a Sl-CathL, comprovadamente digestiva, reforça a sugestão da função digestiva também atribuída a essas outras enzimas. A figura 1.4 indica os tecidos dissecados que foram utilizados para as análises. O corte referente à cabeça foi realizado visando a identificação de prováveis sítios de secreção em glândulas salivares.
Figura 1.4: Tecidos dissecados das larvas com 30 dias de vida para as análises de qRT-PCR.
No entanto, nenhuma enzima digestiva foi identificada com índices consideráveis de expressão na região correspondente à "cabeça" (Figura 1.5), o que sugere, que ao menos para as enzimas analisadas, o sítio de secreção constitui apenas o intestino das larvas do inseto. O gráfico da figura 1.5 representa o padrão geral observado para os transcritos analisados por qRT-PCR nos diferentes tecidos das larvas de S. levis. Para a comparação, foi considerado para cada gene o maior
índice de expressão detectado em todos os tecidos, igual a 1x. Dessa maneira, esse gráfico não representa a diferença de expressão real entre os diferentes genes. Contudo, nessa análise podem ser visualizadas claramente as diferenças entre os níveis de expressão para cada gene nos tecidos das larvas.
Figura 1.5: Gráfico indicando a expressão relativa analisada por qRT-PCR para os genes selecionados nos diferentes tecidos. Para a comparação, os índices máximos de transcrição para cada gene foram utilizados como calibradores (1x). A catepsina L (Sl-CathL), celulase, catepsina B, invertase e esterase são sintetizadas fundamentalmente no intestino médio (IM) das larvas, como esperado para enzimas digestivas. A detecção de ESTs da serino peptidase no intestino posterior (IP) é controversa, desde que essa região é normalmente revestida por quitina. As outras proteínas como a serpina, V-ATPase, catepsina D e duas proteínas de função desconhecida (Fat 1 e 2) são transcritas em níveis elevados nos tecidos além do intestino médio, o que indica a participação em processos não digestivos.
Os resultados de qRT-PCR obtidos para a Sl-CathL servem como padrão para a identificação de outras enzimas digestivas, considerando a comprovação da atuação digestiva dessa enzima, descrita no capítulo 2. Os primers utilizados para a análise da Sl-CathL são específicos para a variantes 1, correspondente a rSl-CathL. Na figura 1.5 é observado que o padrão de expressão da celulase (β-1,4- endoglucanase), catepsina B, invertase e esterase é muito similar ao da catepsina L. Verifica-se que a síntese de RNAm para essas enzimas ocorre fundamentalmente no intestino médio das larvas, como esperado para enzimas digestivas.
As outras proteínas como a serpina, V-ATPase, catepsina D e duas proteínas de função desconhecida (Fat 1 e 2) são transcritas em níveis consideráveis em outros tecidos além do intestino médio, o que indica a participação em outros processos não digestivos. Os perfis de expressão da V-ATPase e serpina são discutidos em detalhes no capítulo 3, considerando esses genes como alvos para o silenciamento.
Assim como na análise anterior, a expressão gênica relativa avaliada durante as fases do desenvolvimento de S. levis não aponta as verdadeiras diferenças entre as abundâncias dos transcritos, mas facilita a compreensão por meio da comparação dos perfis identificados. As enzimas que tiveram a transcrição previamente identificada no intestino do inseto atingem os maiores índices de expressão nas larvas com 30 dias de vida (Figura 1.6), com exceção da celulase que é mais abundante no estágio anterior (20 dias). Como esperado para enzimas digestivas, a transcrição é reduzida nas pré-pupas quando os insetos cessam a alimentação e é praticamente nula no estágio pupal.
Figura 1.6: Gráfico da análise da expressão gênica relativa durante as fases do desenvolvimento de
S. levis analisadas por qRT-PCR. Para o efeito comparativo da análise, os índices máximos de
transcrição detectados para cada enzima ao longo do ciclo de vida do inseto foram tomados como calibradores (1x). Assim, os níveis de transcrição das enzimas não refletem as diferenças reais considerando as abundâncias entre si. As enzimas digestivas, fundamentalmente produzidas no
intestino médio, atingem os maiores índices de expressão nas larvas com 30 dias de vida, com exceção da celulase que é mais abundante no estágio anterior (20 dias). Essas enzimas têm a transcrição reduzida nas pré-pupas e praticamente anulada na fase de pupa. A catepsina D foi detectada em todos os tecidos e fases do desenvolvimento, o que sugere a atuação não digestiva dessa enzima.
Na figura 1.7 os índices de transcrição dos genes analisados por qRT-PCR são apresentados pelas diferenças reais observadas entre a abundância de seus transcritos. A predominância da catepsina L está de acordo com o observado na biblioteca e também na análise de atividade peptidásica de cisteíno peptidases no intestino médio das larvas de S. levis (Soares-Costa et al., 2011). As catepsinas B também contribuem para a atividade de cisteíno peptidases no intestino das larvas do inseto e a detecção minoritária de serino peptidases (tipo tripsina) também foi verificada no intestino, de acordo com as observações prévias do relato da atividade dessa enzima (Soares-Costa et al., 2011).
Figura 1.7: Gráfico do perfil de expressão gênica das diversas enzimas de Sphenophorus levis durante o ciclo biológico do inseto. Esses resultados correspondem à expressão relativa real entre os genes estudados. As cisteíno peptidases são predominantes em função da abundância de transcritos de catepsinas L e minoritária de catepsinas B.
1.3.5 Peptidases identificadas no transcriptoma das larvas de S. levis