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A detecção de ESTs da serino peptidase no intestino posterior é controversa, desde que essa região é normalmente revestida por quitina. A ação de serino peptidases é relatada no final do intestino médio de Tenebrio molitor (Vinokurov et al., 2006, Prabhakar et al., 2007) e Tribolium castaneum (Vinokurov et al., 2009),

ambos insetos da família Tenebrionidae. Para Costelytra zealandica (Coleoptera: Scarabaeidae) a atividade de serino peptidases foi também detectada no intestino posterior, ainda que diminuída 15 vezes em relação à atividade detectada no intestino médio (Gatehouse et al., 2009). Em Rhyzopertha dominica (Coleoptera: Bostrichidae) 16% da atividade total de tripsinas foi detectada no intestino posterior de insetos adultos, mas os autores atribuíram essa atividade ao fluxo de enzimas provenientes do intestino médio (Zhu e Baker, 1999).

Curiosamente, na análise de atividade das tripsinas a partir das frações do intestino de S. levis, a atividade máxima dessas enzimas foi verificada em pH acima de 8,0. A detecção da atividade decrescente de tripsinas ao longo do conteúdo do intestino médio é incongruente com os valores de pH observados ao longo do intestino médio das larvas de S. levis que variam de 5,5 na região anterior (V1) a 7,6 na região posterior (V4) (Soares-Costa et al., 2011), mas essa distribuição pode ainda ser justificada pelo fluxo das enzimas nos espaços endo e ectoperitróficos, relacionado à reciclagem das mesmas (Terra e Ferreira, 2011).

Nesse sentido, o aparente artefato da detecção da expressão da tripsina analisada no intestino posterior, onde o pH deve ser mais elevado, ganha uma sustentação fisiológica para a ocorrência atípica dessa enzima. Ainda, a não detecção desses transcritos no intestino médio exclui a possibilidade de contaminação entre os tecidos. No entanto, a suposição de que a tripsina mais abundante de S. levis, correspondente ao contig 111, seja de fato produzida no intestino posterior é indicada exclusivamente pelos resultados de qRT-PCR, o que não exclui a possibilidade de atuação intracelular. Pelo fato do intestino posterior de insetos ser geralmente revestido por quitina, outros estudos como a imunolocalização da enzima são necessários para confirmar a atuação digestiva dessa tripsina.

Além disso, os primers utilizados para as análises de expressão gênica da serino peptidase são específicos para o contig 111, o mais abundante dentre as serino peptidases identificadas, que é formado por 7 sequências que codificam uma tripsina. O padrão de transcrição não foi analisado para os outros dois contigs, formados por 6 e 3 ESTs (contigs 128 e 200, respectivamente), que codificam quimotripsinas (Figura 1.8B). Outras 12 sequências únicas e um contig contendo

duas sequências de serino peptidases não foram sequenciados por completo e caracterizados.

Figura 1.8B: Alinhamento das sequências de proteínas dos contigs de serino peptidases identificados na biblioteca de larvas de S. levis. O contig 111 é formado por 7 sequências e codifica uma provável tripsina. A caixa pontilhada corresponde à extremidade N-terminal conservada das tripsinas (IVGG). Os resíduos do sítio ativo das serino peptidases, histidina (His57) e ácido aspártico (Asp102), são indicados por um asterisco e a serina reativa (Ser195) é indicada por uma cabeça de seta. A seta e a caixa branca indicam o resíduo conservado de ácido aspártico (Asp189) que confere especificidade às tripsinas, que é substituído por uma serina, glicina ou tirosina nas quimiotripsinas (Terra e Ferreira, 2011). Os resíduos idênticos são marcados em caixas escuras e aqueles conservados são indicados em caixas cinza.

Nas análises de atividade de serino peptidases no intestino das larvas de S. levis, previamente relatadas por Soares-Costa e colaboradores (2011) foi detectada a atividade de, ao menos, duas tripsinas e nenhuma atividade considerável de quimotripsinas. Os resultados obtidos a partir da análise da biblioteca de S. levis indicam que, muito provavelmente, ao menos uma outra tripsina digestiva deve ser codificada por um dos singlets de serino peptidases. Ainda, os dois contigs que codificam quimotripsinas podem não codificar enzimas de fato digestivas, uma vez que a atividade dessas enzimas não foi detectada anteriormente no intestino médio das larvas de S. levis. Estudos mais detalhados, como imunolocalização ou mesmo qRT-PCR, são necessários para a confirmação da função dessas serino peptidases identificadas no transcriptoma.

1.3.5.3 Catepsina D

A catepsina D é a aspartil protease mais estudada em artrópodes e pode participar da proteólise intra ou extracelular (Lenarcic et al., 1991; Terra e Ferreira,

1994). Essas enzimas têm preferência por pH ácido variando entre 3 e 5, e o mecanismo de catálise é baseado em dois resíduos de aspartato no sítio ativo. A atuação da catepsina D nos processos fisiológicos dos insetos é muito ampla: na mosca do mediterrâneo (Ceratitis capitata) promove a histólise do corpo gorduroso (Rabossi et al., 2004). No bicho da seda (Bombyx mori) está relacionada à apoptose e à muda do estágio de larva para pupa (Gui et al., 2006). Em mosquitos, modula a produção e degradação da vitelogenina (Cho e Raikhel, 1992), e atua na digestão de proteínas presente no sangue ingerido por ácaros e carrapatos (Boldbaatar et al., 2006).

Em coleópteros a catepsina D pode ser secretada no intestino médio de diversas espécies, especialmente daquelas que produzem essencialmente cisteíno proteases como principal enzima digestiva (Silva e Xavier-Filho, 1991; Brunelle et al., 1999). Foi demonstrado que a catepsina D encontrada no intestino do besouro do Colorado (Leptinotarsa decemlineata) tem a capacidade de iniciar a hidrólise de um inibidor de cisteíno peptidases adicionado à dieta. A completa digestão do inibidor, cistatina da soja, se dá pela ação de cisteíno e serino peptidases que atuam após a clivagem inicial promovida pela catepsina D (Brunelle et al., 1999).

Em C. maculatus, as aspartil peptidases tipo catepsina D são encontradas no extrato do intestino representando aproximadamente 10% do total de atividade proteolítica (Kitch e Murdock, 1986; Ahn e Zhu-Salzman 2009). Nesse inseto, essas peptidases também são relatadas como enzimas relacionadas à resposta adaptativa induzida pela adição de inibidores de cisteíno peptidases (Ahn e Zhu-Salzman, 2009).

A atividade de aspartil peptidases tipo catepsina D também foi detectada no intestino das larvas de T. castaneum (Blanco-Labra et al., 1996), porém em um estudo mais recente foi constatado que essa atividade proteolítica detectada em extratos do intestino é decorrente da liberação de aspartil peptidases intracelulares, e não digestivas (Vinokurov et al., 2009). Em Tenebrio molitor, a existência de aspartil peptidases digestivas também é improvável (Terra e Christofoletti,1996; Vinokurov et al., 2006).

O perfil de transcrição gênica identificado para a catepsina D de S. levis difere completamente daqueles observados para as outras enzimas analisadas. A detecção de transcritos dessa enzima em todos os tecidos e durante todo o

desenvolvimento do inseto sugere fortemente a atuação dessa aspartil peptidase de S. levis em processos não digestivos, assim como identificado para T. molitor e T. castaneum. Na figura 1.9A é indicado o alinhamento entre a sequência de aminoácidos da catepsina D de S. levis com as proteínas homólogas de outros insetos, incluindo as catepsinas D caracterizadas como enzimas digestivas em Musca domestica (Diptera) (Padilha et al., 2009).

Figura 1.9A: Alinhamento entre a catepsina D de S. levis e outras aspartil peptidases de insetos. As caixas escuras mostram os aminoácidos idênticos e as caixas cinza indicam os aminoácidos em sítios conservados, que apresentam características similares. A seta indica o provável peptídeo sinal da Sl-

CathD e a cabeça de seta o provável sítio de N-glicosilação (Asn122). Os asteriscos indicam os resíduos de aspartato (D) do sítio ativo dessas enzimas, enquanto a caixa sem preenchimento evidencia a presença do loop de prolinas "DxPxPx(G/A)P", característico das catepsinas lisossomais descrito por Padilha e colaboradores (2009).

As catepsinas D digestivas CAD 2 e CAD 3 de M. domestica não possuem um loop de prolinas "DxPxPx(G/A)P", característico das catepsinas lisossomais descrito por Padilha e colaboradores (2009), que é evidente em todas as outras catepsinas D de insetos, incluindo a CAD 1 de M. domestica e a catepsina D de S. levis (Figura 1.9A). Essa assinatura reforça a observação feita a partir das análises de RT-PCR da catepsina D de S. levis, e também a ausência da atividade de aspartil peptidases

nos ensaios de caracterização enzimática utilizando as frações de conteúdo do intestino (Soares-Costa et al., 2011).