Após preparação dos compostos de vanádio, estes podem ser adicionados à condição de cristalização das proteínas (co-cristalizacao) ou a cristais já formados das mesmas (soaking). No fim dos ensaios de cristalização, os cristais foram congelados em azoto liquido, após terem sido mergulhados numa solução contendo 30% de glicerol. Este agente exerce uma ação crio-protetora, uma vez que impede a formação de gelo no interior do cristal.
Os cristais foram analisados, e vários conjuntos de dados foram recolhidos recorrendo a radiação de sincrotrão no ESRF (em Grenoble, França), e no Soleil (em Paris, França).
Compostos de vanádio com a proteína HEWL
Os melhores cristais obtidos foram originados pela condição 0,1 M de tampão acetato de sódio a pH 4,5, e 6% de NaCl, tendo sido escolhidos para as próximas fases do trabalho.
Figura 4.1 – Cristais de HEWL com um tamanho aproximado entre 0,4 e 0,8 mm, obtidos com 0,1 M de tampão acetato de sódio a pH 4,5, e 6% de NaCl.
De modo a formar aductos entre a proteína e os complexos, recorreu-se à técnica de soaking, visando a incorporação dos compostos nos cristais já formados. Para esta etapa foram utilizados vários
56 compostos contendo vanádio, tais como VO(pic)2 com arginina, VO(pic)2 com prolina e V(IV) com prolina. Os compostos foram dissolvidos na solução estabilizadora da proteína, nas concentrações de 10 mM; 5 mM e 2,5 mM de V(IV), tendo sido a solução estabilizadora usada com o objetivo de manter a integridade dos cristais, evitando danos nos mesmos.
Uma vez que já existe uma estrutura cristalina do aducto de HEWL com o complexo VO(pic)2 (Santos et al. 2014), tentou aprofundar-se a existência desta interação, utilizando aminoácidos biológicos naturais já existentes no organismo humano, como a prolina, que possui uma estrutura molecular semelhantes à do ligando Hpic (consultar imagem 1.5 na secção 1.1.3 da Introdução), e a arginina, de modo a verificar se estes conseguiriam formar complexos com o vanádio, ligando-se ao centro ativo das proteínas, e mimetizar ou substituir a ação do Hpic. Os ligandos foram incubados com V(IV) numa proporção que visava a formação de complexos sob a forma de VO(ligando)2.
Na Tabela 4.1 encontram-se os dados relativos aos cristais de HEWL com os vários compostos. Tabela 4.1 – Resumo das condições e resultados da difração dos cristais de HEWL com os compostos de vanádio VO(pic)2 com arginina, VO(pic)2 com prolina e V(IV) com prolina obtidos por soaking, com solução precipitante 0,1
M Tampão acetato de sódio a pH 4,5, e 6% NaCl, e analisados por radiação de Sincrotrão (ESRF e Soleil). Proteína Composto Linha do Sincrotrão Resolução máxima
HEWL 50 mg/mL
VO(pic)2 com arginina,10
mM ESRF ID29 1,12 Å
VO(pic)2 com arginina, 5
mM Proxima I Soleil 1,4 Å
VO(pic)2 com prolina,
10 mM ESRF ID29 1,39 Å
VO(pic)2 com prolina,
5 mM Proxima I Soleil 1,4 Å
V(IV) com prolina,
10 mM ESRF ID29 1,12 Å
V(IV) com prolina, 2,5 mM Proxima I Soleil 1,3 Å
Compostos de vanádio com a proteína tripsina
Os melhores cristais de tripsina, tanto a 30 mg/mL como 60 mg/mL, foram obtidos recorrendo a 0,2 M de sulfato de amónio e 30% de PEG 8000 (condição 30, do screen Crystal Screen HT), apresentando não só um maior tamanho e tridimensionalidade, como também um maior número de cristais por gota. A cristalização da tripsina é geralmente feita na presença de um inibidor, como a benzamidina, que ao ligar-se ao centro ativo da mesma previne a sua autocatálise (Renatus et al. 1998; Jiang et al. 2000). Apesar dos cristais na presença de benzamidina serem mais abundantes, foi possível obter alguns cristais de tripsina na ausência de benzamidina, embora em menor quantidade, em algumas gotas.
57 Figura 4.2 – Cristais de tripsina 30mg/ml obtidos na presença (A) e na ausência (B) de benzamidina, utilizando a condição 30.
Foram então levados a cabo os ensaios de co-cristalização dos compostos de vanádio com a tripsina 30 mg/mL e 60 mg/mL com e sem benzamidina, utilizando as condições 15; 20; 30 e 31. Os compostos utilizados foram V(IV), VO(pic)2, VO(dipic)2, VO(maltol)2, VO(dhp)2 e V(V), dissolvidos no tampão da proteína, numa concentração de 10 mM de V(IV), tal como descrito na secção 3.1.1.2 dos Materiais e Métodos.
De todos os compostos usados, obtiveram-se cristais de tripsina apenas na presença dos compostos V(IV), VO(pic)2 e VO(dipic)2.
Os cristais obtidos foram analisados, e os respetivos dados da difração encontram-se discriminados na Tabela 4.2.
58 Tabela 4.2 – Resumo das condições e resultados de difração dos cristais de tripsina com os compostos de vanádio V(IV), VO(pic)2 e VO(dipic)2 obtidos por co-cristalização e analisados por radiação de Sincrotrão (ESRF e Soleil).
Proteína Composto Condições de co-cristalização Sincrotrão Linha do Resolução máxima Tripsina 30 mg/mL
c/ benzamidina V(IV) Condição 30 Proxima I Soleil Não difratou Tripsina 30 mg/mL
s/ benzamidina V(IV) Condição 31 Proxima I Soleil 1,031 Å Tripsina 60 mg/mL
c/ benzamidina V(IV) Condição 30 ESRF ID29 Não difratou Tripsina 60 mg/mL
s/ benzamidina V(IV) Condição 30 Proxima I Soleil 1,031 Å Trispina 30 mg/mL
s/ benzamidina VO(pic)2 Condição 30 Proxima I Soleil 1,09 Å Trispina 30 mg/mL
c/ benzamidina VO(pic)2 Condição 30 Proxima I Soleil 1,031 Å Trispina 60 mg/mL
c/ benzamidina VO(pic)2 Condição 30 Proxima I Soleil Sal Tripsina 30 mg/mL
c/ benzamidina VO(dipic)2 Condição 31 ESRF ID29 3 Å
Posteriormente, foram também realizados ensaios de cristalização quer por co-cristalização, quer por
soaking, da tripsina com os compostos VO(pic)2 com arginina, VO(pic)2 com prolina e V(IV) com prolina. Porém, face aos resultados obtidos anteriormente, a cristalização foi restringida em dois pontos: a) foi apenas utilizada a proteína com concentração de 30 mg/mL, uma vez que face aos resultados das cristalizações anteriores, não foram reveladas diferenças significativas entre uma concentração e a outra, o que nos permite utilizar uma concentração mais baixa, e consequentemente menos proteína, sem no entanto comprometer os ensaios e respetivos resultados; b) apenas se utilizou a tripsina sem benzamidina, uma vez que a proteína cristaliza, a ausência da benzamidina permite-nos verificar se os compostos se ligam ao centro ativo da proteína, e caso o façam, estudar a sua interação e estrutura. A co-cristalização foi realizada com os compostos numa concentração de 10 mM de V(IV), e usando as condições 15; 20; 30 e 31, tal como descrito na secção 3.1.1.2 dos Materiais e Métodos. Já o soaking foi realizado através da transferência de cristais de tripsina 30 mg/mL sem benzamidina, para a solução estabilizadora da proteína de cada uma das quatro condições (Tabela 3.1 da secção 3.1.1.2 dos Materiais e Métodos), contendo os compostos nas concentrações 10 mM; 5 mM e 2,5 mM de V(IV). Os resultados da difração dos cristais analisados encontram-se na Tabela 4.3.
59 Tabela 4.3 – Resumo das condições e resultados de difração dos cristais de tripsina com os compostos de vanádio VO(pic)2 com arginina, VO(pic)2 com prolina e V(IV) com prolina tanto por co-cristalização, como por soaking, e
analisados por radiação de Sincrotrão (ESRF e Soleil).
Proteína Composto Condições de cristalização Sincrotrão Linha do Resolução máxima
Tripsina 30 mg/mL s/ benzamidina
VO(pic)2 com
arginina (1) Co-cristalização Condição 30 Proxima I Soleil 1,4 Å VO(pic)2 com
arginina (2) Co-cristalização Condição 31 Proxima I Soleil 1,3 Å VO(pic)2 com
prolina (1) Co-cristalização Condição 20 ESRF ID29 1,2 Å VO(pic)2 com
prolina (2) Co-cristalização Condição 30 ESRF ID29 Não difratou V(IV) com prolina,
10mM (1) Condição 30 Soaking Proxima I Soleil 1,8 Å V(IV) com prolina,
10mM (2) Condição 31 Soaking Proxima I Soleil 1.5 Å V(IV) com prolina,
10 mM (3) Condição 20 Soaking ESRF ID29 1,1 Å V(IV) com prolina,
2,5 mM
Soaking
Condição 30 Proxima I Soleil 1,4 Å
Experiência de difração, resolução e refinamento da estrutura
Tanto para os cristais obtidos da HEWL, como da tripsina, com os compostos de vanádio apresentados anteriormente, foi selecionado o conjunto de dados com maior resolução, os quais foram processados utilizando o programa XDS. (Kabsch 2010)
As reflexões foram indexadas e integradas, e as constantes da célula foram refinadas. As estruturas foram resolvidas pelo método da substituição molecular usando como modelo estruturas depositadas na base de dados do PDB (PDB, www.rcsb.org/pdb/) de alta resolução das mesmas proteínas (descrição mais detalhada na próxima secção). Com base nas fases iniciais estimadas, os mapas de densidade eletrónica foram inspecionados para analisar a presença ou ausência de aductos da proteína com os complexos metálicos. Apesar de se ter procedido de igual modo para todos os cristais, verificou- se que apenas os cristais de tripsina 30 mg/mL sem benzamidina com o composto VO(pic)2 obtido por co-cristalização, na condição 30 (da Tabela 4.2), e com o composto VO(pic)2 com arginina obtido por co-cristalização, na condição 31 (da Tabela 4.3), mostravam ter uma densidade anómala referente ao átomo de vanádio na estrutura, indicativa de que o composto poderia encontrar-se ligado à proteína. Assim, os vários conjuntos de dados, quer de HEWL quer de tripsina, cujo soaking/co-cristaização não foram alcançados com sucesso, foram abandonados, e a análise das estruturas prosseguiu apenas para a estrutura da tripsina com o complexo VO(pic)2 – a estrutura de tripsina na presença de V(IV) e arginina encontra-se ainda numa fase muito primária de refinamento, pelo que não será abordada nesta dissertação.
4.1.1.3.1 – VIVO(pic)
2–tripsina
Como referido anteriormente o cristal de tripsina com o composto VO(pic)2 difratou até 1,09 Å, e recorreu-se ao programa XDS para indexar as imagens recolhidas do cristal aquando a sua experiência
60 de difração, e obter os parâmetros que caracterizam a célula unitária (constantes a, b, c e ângulos α, β, γ). Os resultados obtidos encontram-se na Tabela 4.4, onde se pode concluir que dado a=b≠c e que α=β=90ºe γ=120º, o cristal pertence ao sistema cristalino hexagonal.
Utilizou-se o programa AIMLESS (Evans 2011)presente no conjunto de programas cristalográfico CCP4 (Dodson 1987) para determinar o grupo espacial mais provável, tendo em conta tendo em conta a posição relativa das reflexões e os elementos de simetria que as relacionam, bem como para escalar os dados e analisar a qualidade dos mesmos, podendo as intensidades das reflexões medidas não se encontrar na mesma escala – limitação esta que o programa AIMLESS ajuda a ultrapassar. Determinou-se que o cristal pertencia ao grupo espacial P3121, e as estatísticas referentes aos dados recolhidos encontram-se discriminadas na Tabela 4.4.
Tabela 4.4 – Estatísticas da recolha e qualidade dos dados de difração para o cristal. R𝑚𝑒𝑟𝑔𝑒=∑ |Ik| −| <𝐼> | ∑ |Ik| , onde
Ik corresponde à intensidade de cada reflexão e <I> corresponde à intensidade média de cada reflexão a partir de observações múltiplas; VM =Z×MpV , onde V é o volume da célula unitária, Z é o número de unidades assimétricas presentes na célula unitária, e Mp é a massa molecular da proteína; Conteúdo de solvente = (1 −1,23VM) × 100
Parâmetros Valores globais Camada externa de resolução
Comprimento de onda (Å) 1,04 – Grupo espacial P312 1 – Constantes da Célula unitária (Å, º) a = b = 54,52, c = 108,2 α = β = 90, γ = 120 – Resolução (Å) 47,22-1,09 1,11-1,09 <I/σI> 8,2 2,2 CC1/2 0,995 0,761
Número de Reflexões totais 423729 19569
Número de Reflexões únicas 78462 3802
Rmerge(%) 8,6 59,5
Multiplicidade 5,4 5,1
Mosaicidade (º) 0,04 –
Completeness (%) 100 100
Número de moléculas por unidade
assimétrica 1 –
Coeficiente de Matthews (VM)
(Å3/Da) 1,98 –
Conteúdo em solvente (%) 37,78 –
De modo a confirmar a qualidade dos dados recolhidos inspecionaram-se vários parâmetros, como o número de reflexões recolhidas, a relação entre intensidade da reflexão e nível de ruído, entre outros. O parâmetro <I/σI> traduz o erro associado aos dados de difração (Wlodawer et al. 2008). O seu valor é de 8,2, o que nos indica que a intensidade medida para as reflexões do cristal é 8,2 vezes superior ao valor do desvio padrão das intensidades em questão, indicando, numa primeira análise, a qualidade dos dados de difração do cristal. O coeficiente de correlação, CC1/2 também é um parâmetro indicativo
61 da qualidade dos dados, usando apenas metade dos dados de cada reflexão única que são medidos, divididos de uma forma aleatória, sendo calculado entre as intensidades médias de cada subconjunto de dados (Karplus & Diederichs 2012). CC1/2 fornece igualmente uma avaliação direta da relação entre sinal/ruído que contribuem para a variação dos dados na camada de resolução, sendo ainda um indício da existência ou não de erros sistemáticos dos dados, que possam derivar de uma incorreta distribuição das intensidades das reflexões (Diederichs & Karplus 2013). O seu valor deve ser superior a 0,5 para a camada de resolução mais elevada (Karplus & Diederichs 2012), e para o caso concreto, é de 0,995.
O Rmerge é outra medida utilizada para determinar a qualidade dos dados experimentais, a qual reflete
a concordância entre reflexões equivalentes, e o seu valor deve situar-se entre os 5% e os 10% (Wlodawer et al. 2008), como é o caso do cristal em estudo, apresentando um valor de 8,6%. O seu valor pode aumentar até 50% na camada externa de resolução, tal como se verifica.
A multiplicidade deste conjunto de dados é de 5,4, e é calculada através da razão entre o número de reflexões únicas (não relacionadas por simetria) e o número de reflexões totais, sendo um parâmetro que indica o número de vezes que uma reflexão foi medida, assumindo que, quanto maior o valor de multiplicidade, mais precisa será a estimativa das intensidades associadas a cada reflexão e respetivo erro. (Wlodawer et al. 2008)
Por outro lado, a mosaicidade revela o grau de organização da rede cristalina, representando o desfasamento das várias células unitárias no espaço tridimensional do cristal. O cristal medido apresenta um valor de mosaicidade 0,04º, indicativo de que o cristal se encontra bem ordenado. (Carvalho et al. 2009)
Os dados recolhidos encontram-se completos já que, para a resolução selecionada todas as reflexões possíveis foram medidas, o que se traduz em termos percentuais pela completeness. (Wlodawer et al. 2008)
De acordo com o coeficiente de Matthews, o cristal apresenta 37,8% de solvente com apenas uma molécula de tripsina por unidade assimétrica. Este coeficiente relaciona o volume da célula unitária com a massa molecular da proteína em estudo. Estatisticamente, cristais de proteína apresentam um conteúdo de solvente entre 30-70%.
É então possível afirmar, que qualquer um dos parâmetros até aqui discutidos aponta para uma boa qualidade dos dados de difração recolhidos para o cristal.
Para iniciar a resolução da estrutura, é necessário calcular o ângulo da fase de cada reflexão, de modo a se obterem os fatores de estrutura (Fhkl) necessários para o cálculo dos mapas de densidade eletrónica. Para tal, foi utilizado o método de Substituição Molecular (MR), dado que a estrutura desta proteína já é conhecida, selecionando-se a estrutura com o código 1S0Q, depositada no PDB, como modelo, e utilizando o programa PHASER (McCoy et al. 2007) do CCP4.
62 A estrutura escolhida apresenta uma resolução bastante elevada de 1,02 Å, sendo bastante semelhante à estrutura em estudo, e possuindo apenas um ião cálcio como ligando – o qual foi removido, bem como todas as moléculas de água da estrutura, utilizando-se apenas a cadeia polipeptídica.
Após a escolha da estrutura, é então possível proceder à substituição molecular, a qual foi feita recorrendo ao programa PHASER. Este programa calcula os ângulos da fase (αhkl) necessários para o cálculo dos fatores de estrutura, usando as funções de rotação e translação para procurar uma molécula de proteína na unidade assimétrica.
Através dessas mesmas funções de rotação e translação, foi encontrada a solução para o conjunto de dados no grupo espacial P3121 do cristal, apresentando valores de LLG (Log Likelihood Gain) e Z-
score bastante elevados, tanto de rotação (LLG de 92 e Z-score de 3,3) como de translação (LLG de
7598 e Z-score de 8,2).
O parâmetro LLG quantifica o quão melhor os dados experimentais podem ser previstos, utilizando o modelo em causa, do que com uma distribuição aleatória dos mesmos átomos, sendo que quanto maior o seu valor, mais correta é a previsão, enquanto o Z-score funciona como uma medida do desvio padrão da solução encontrada face à média, sendo que para ambos os casos, os valores encontram-se dentro do expetável.
De acordo com os resultados, é possível concluir que a estrutura foi resolvida, tendo-se obtido assim os fatores de estrutura e as fases (que permitem calcular mapas de densidade eletrónica) da estrutura do complexo de tripsina com VO(pic)2.
Nesta etapa toda a informação necessária para proceder com o refinamento da estrutura foi obtida – refinamento esse, que é crucial para a obtenção do modelo final. O refinamento consiste em, progressivamente, ajustar o modelo à sua densidade eletrónica, minimizando as diferenças entre os fatores de estrutura observados (Fo) e os fatores de estrutura calculados (Fc) anteriormente.
A estrutura foi refinada recorrendo ao programa REFMAC5 (Murshudov et al. 2011) do CCP4, e as estatísticas obtidas encontram-se na Tabela 4.5.
Também através do programa Coot (Emsley & Cowtan 2004), foi possível manipular o modelo, auxiliando o seu ajuste à densidade eletrónica.
63 Tabela 4.5 – Estatísticas do refinamento final da estrutura de VOIV(pic)2–tripsina.
VOIV(pic)
2-Tripsina
Fator R (%) 11,14
Rfree (%) 13,62
RMSD para o comprimento de ligação (Å) 0,015
RMSD para o ângulo de ligação (º) 1,813
Gráfico de Ramachandran (%) - resíduos nas regiões mais favoráveis
- resíduos nas regiões permitidas - resíduos nas regiões não permitidas
96,35 3,65
0
Analisando as estatísticas da Tabela 4.5, podemos concluir que o modelo se encontra bem refinado e pronto a depositar na base de dados do PDB. O fator R obtido de 11,14% mostra que existe uma boa relação entre os fatores de estrutura calculados e os observados, devendo o seu valor ser o mais pequeno possível indicando que o modelo foi bem construído ao longo do refinamento. O fator Rfree é
outro parâmetro importante na avaliação da concordância entre o modelo calculado e os dados observados, sendo calculado da mesma forma que o fator R, mas usando apenas 5% das reflexões (separadas previamente aquando o uso do programa AIMLESS, e não utilizadas para o cálculo da estrutura). Torna-se importante a comparação entre ambos os fatores R e Rfree, pois discrepâncias
muito elevadas entre os seus valores podem indicar que existem problemas no ajuste do modelo. O Rfree não deve ser superior ao fator R por mais de 5% (Wlodawer et al. 2008),tal como se verifica na
estrutura em estudo.
Os valores de RMSD (Root Mean Square Deviation) que indicam o desvio que a estrutura apresenta em relação aos valores teóricos expectáveis, encontram-se abaixo dos valores considerados razoáveis (0,02 Å em relação ao comprimento de ligação e 3º em relação ao ângulo de ligação).
Por fim, o gráfico de Ramachandran permite averiguar se a maioria dos resíduos de aminoácidos da estrutura se encontram nas regiões mais favoráveis, e consequentemente, uma correta disposição molecular do modelo. O gráfico representa os ângulos de torsão ψ em função de φ para cada aminoácido, sendo estes os ângulos de torsão em torno da cadeia polipeptídica principal (Carvalho et al. 2009), e pela observação dos valores da Tabela 4.5, podemos verificar que a maioria dos resíduos se encontra nas regiões mais favoráveis.
A partir da análise dos parâmetros descritos, pode-se concluir que o modelo está correto e de acordo com os dados experimentais, não apresentando erros significativos, permitindo assim o avanço para a etapa de caracterização e análise da estrutura.
Através do mapa de densidade eletrónica tornou-se possível verificar a existência de um complexo metálico no centro ativo da proteína, que se interpretou como sendo o metal de vanádio, coordenado com dois ligandos de Hpic (ambos sob a forma de pic), um átomo de oxigénio, e à cadeia lateral do resíduo de Ser195, numa geometria octaédrica: para tal criou-se um mapa de densidade anómala, recorrendo-se ao programa CAD e FFT (Read & Schierbeek 1988) do CCP4. A identificação foi feita
64 com base no facto de o complexo possuir o átomo de vanádio, um metal de transição, que consegue absorver os raios-X e difratá-los de forma diferente – provocando uma alteração da fase das reflexões, quando comparado com outros átomos tais o carbono, o oxigénio e o hidrogénio. (Rhodes 2006)
Figura 4.3 – Representação gráfica da estrutura do complexo VIVO(pic)2–tripsina. O mapa 2Fo-Fc (a azul) possui
um contorno de 1σ, enquanto o mapa de densidade anómala (a amarelo) possui um contorno de 3σ. A imagem foi construída no programa Pymol (DeLano 2002).
Toda a superfície da estrutura foi analisada, verificando-se que, tal como na estrutura de VIVO(pic)2– HEWL(Santos et al. 2014), o complexo VIVO(pic)2 encontrava-se localizado no centro ativo da proteína, de um modo semelhante à estrutura da HEWL. A ligação do complexo nas estruturas de HEWL e Tripsina ocorreu no centro ativo das proteínas, exibindo uma geometria octaédrica, e no caso do VIVO(pic)2–HEWL foi identificada uma interação com a cadeia lateral do resíduo de Asp52.
O centro ativo da tripsina é conhecido por integrar no seu domínio catalítico a tríade catalítica constituída pelos três resíduos Ser195, His57 e Asp102. Nesta região a enzima apresenta uma fenda na qual se ligam os substratos, onde a serina catalítica (Ser195), se encontra posicionada de um lado, e a His57 e o Asp102 do outro, fazendo uma rede de ligações de hidrogénio entre si, e com alguns resíduos vizinhos. Na Figura 4.4 é possível verificar, com maior detalhe, a ligação do complexo ao centro ativo, e a sua interação com a serina catalítica da tripsina.
65 Figura 4.4 – Representação gráfica da estrutura do complexo VIVO(pic)2–tripsina, com interação detalhada entre
VIVO(pic)2 e o resíduo Ser195 (B), bem como os restantes resíduos da tríade catalítica, His57 e Asp102 (A). O
mapa de densidade 2Fo-Fc (a azul) possui um contorno de 1σ, enquanto o mapa de densidade anómala (a amarelo) possui um contorno de 3σ. O átomo de vanádio encontra-se colorido a amarelo, no centro. A imagem foi construída no programa Pymol.
Estes resultados revelam não só que o vanádio pode ligar-se covalentemente à proteína, no seu centro ativo, como pode manter a coordenação aos ligandos adicionados, aquando da interação com a mesma. Esta característica já tinha sido observada na estrutura da HEWL na presença do mesmo complexo de vanádio (Santos et al. 2014). De acordo com estes dados, é possível extrapolar que alguns complexos de VO(ligando)2 podem ligar-se covalentemente a outras proteínas ou enzimas, e assim desempenhar a sua ação biológica. Este tipo de interação poderá ocorrer também com as proteínas do