Síntese de AuNPs
A solução coloidal de AuNPs foi preparada através do método de redução do citrato (Lee & Meisel 1982). Os reagentes ácido clorídrico (HCl), ácido nítrico (HNO3), ácido cloroáurico (HAuCl4) e citrato de sódio formam adquiridos à Sigma-Aldrich. A caracterização por espectroscopia de UV/visível foi levada a cabo no espectrofotómetro UVmini-1240 da Shimadzy, utilizando células de quartzo de 100 μL 105.202-QS, da Hellma.
Todo o material utilizado para a síntese foi previamente lavado em água-régia, e de seguida com água Mili-Q. A água-régia é uma solução aquosa preparada com 3:1 porções de HCl:HNO3.
250 mL de solução de HAuCl4 (1 mM) foram sujeitos a ebulição, sob agitação, num balão de fundo redondo de 500 mL. Após refluxo constante da solução foram adicionados 25 mL de 38,8 mM de citrato de sódio, perlongando-se o refluxo por mais 20 minutos, em agitação.
46 Após os 20 minutos, a solução coloidal foi arrefecida até atingir temperatura ambiente, filtrada para
falcons de 50 mL e armazenada a 4ºC, tendo-se colocado os falcons envoltos em película de prata
comercial, de modo a se encontrarem protegidos da luz.
A determinação da concentração das AuNPs, e a obtenção do seu espectro de absorção entre 400 a 800 nm foi realizada, por espectroscopia UV/visível, e para obtenção dos dados que permitiram a caracterização das partículas, o espectro foi normalizado a 400 nm.
Funcionalização das AuNPs
3.2.1.2.1 – Funcionalização com PEG: AuNPs@PEG
O biopolímero PEG, e os reagentes dodecil sulfato de sódio (SDS), hidrogenofosfato de sódio (Na2HPO4), dihidrogenofosfato de sódio (NaH2PO4) e ácido 5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzóico) (DTNB) foram adquiridos à Sigma-Aldrich. A agitação da solução contendo a mistura de AuNPs e PEG foi levada a cabo na shaker GFL 3016, da Gesellschaft für Labortechnik, e a centrifugação foi feita na centrífuga 3-16K, da Sigma-Aldrich. As absorvâncias foram lidas no leitor de microplacas Infinite M200 da Tecan.
Para funcionalização das AuNPs com 100 % PEG preparou-se uma solução contendo 0,035 mg/mL de PEG, 10 nM de AuNPs e 0,028% (m/V) de SDS, perfazendo-se o volume com água Mili-Q até 50 mL. A solução foi incubada à temperatura ambiente na shaker GFL 3016, durante 16 horas, após as quais foi removido o excesso de PEG, centrifugando-se 3x a 14000 g, durante 30 minutos, a 4ºC. A cada centrifugação, os sobrenadantes eram removidos e guardados em falcons, sendo que o volume removido era substituído pelo mesmo volume de água Mili-Q. Após a última centrifugação o pellet foi recolhido e armazenado a 4ºC.
Finalizado o processo de funcionalização, e tendo-se guardado todos os sobrenadantes resultantes das 3 centrifugações, estes foram novamente centrifugados nas mesmas condições, e então analisados pelo método de Ellman’s. Este método visa quantificar o número de cadeias tióis existentes no sobrenadante de modo a determinar-se, por interpolação, a quantidade de moléculas de PEG que funcionalizaram às AuNPs.
Para o método de Ellman’s foi utilizada uma placa de 96 poços, e usado o tampão fosfato a 0,5 M, pH 7, preparado através de uma mistura de Na2HPO4 (288,5 M) e NaH2PO4 (211,5 M). Aos poços foram adicionados 200 µL de cada sobrenadante, 100 µL de tampão fosfato a 0,5 M, pH 7 e 7 µL de 2 mg/mL do reagente de Ellman’s (DTNB, preparado por dissolução no tampão fosfato 0,5 M, pH 7, incubado à temperatura ambiente durante 15 minutos). No mesmo ensaio foi feita uma curva de calibração para o PEG, utilizando uma gama de concentrações de 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 e 0,5 mg/mL, procedendo-se do mesmo modo para os sobrenadantes, com a diferença que os sobrenadantes foram substituídos por PEG, nas várias concentrações descritas. Procedeu-se então à leitura das absorvâncias entre 400 a 600 nm no leitor de microplacas, e o tratamento dos dados foi feito numa folha de cálculo do software Excel.
47 Procedeu-se ainda à obtenção do espectro de absorção das AuNPs@PEG entre 400 a 800 nm, por espectroscopia UV/visível, e para obtenção dos dados que permitiram a caracterização das partículas, o espectro foi normalizado a 400 nm.
3.2.1.2.2 – Funcionalização com proteínas: AuNPs@PEG@BSA e AuNPs@PEG@HEWL
Os reagentes N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS), carbodimina hidroclorídrica 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil) (EDC), ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) foram adquiridos à Sigma- Aldrich, e o kit Pierce™ Coomassie (Bradford) Assay Reagent à Thermo Scientific. As proteínas BSA e HEWL, utilizadas para funcionalização, foram adquiridas à Sigma-Aldrich.
A funcionalização das AuNPs@PEG com as proteínas BSA e HEWL foi realizada através da reação de EDC/NHS (Bartczak & Kanaras 2011). Foi preparada uma solução contendo 21 nM de AuNPs@PEG, 1,25 mg/mL de sulfo-NHS, e 0,312 mg/mL EDC, dissolvidos em tampão MES a 10 mM, pH 6. A mistura foi incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente, e depois centrifugada a 14000 g, durante 30 minutos, a 4ºC. O sobrenadante foi removido e substituído por um volume equivalente de tampão MES a 2,5 mM, pH 6. Foram adicionados 700 µL da solução em 4 eppendorfs diferentes, de modo a obter a funcionalização com BSA 10 µg/mL, e HEWL a 2,5; 5 e 10 µg/mL (solução stock de 0,2 mg/mL das proteínas liofilizadas, dissolvidas em água Mili-Q) – dado não existirem quaisquer estudos acerca da funcionalização de AuNPs com a HEWL, foram testadas três concentrações diferentes para uma concentração fixa de AuNPs@PEG, procedendo-se do mesmo modo, e utilizando as mesmas condições que as usadas para a funcionalização de AuNPs@PEG com BSA. Para cada um dos 4
eppendorfs foi ainda adicionada água Mili-Q, perfazendo o volume até 1 mL. A mistura resultante foi
incubada com agitação, à temperatura ambiente, durante 16 horas.
Tal como descrito para a funcionalização com PEG, após as 16 horas de incubação, as soluções foram centrifugadas 3x a 14000 g, durante 30 minutos, a 4ºC, removendo-se nas 3x os sobrenadantes, e adicionando um volume equivalente de tampão MES a 2,5 mM, pH 6. Uma vez que os sobrenadantes continham o excesso das proteínas BSA e HEWL que não se ligaram às AuNPs@PEG, estas foram quantificadas pelo método de Bradford, de modo a se poder posteriormente determinar a quantidade de proteína que se ligou às partículas.
Para o ensaio de Bradford, levado a cabo no leitor de microplacas, recorreu-se a uma placa de 96 poços, onde foram adicionados 150 µL de cada sobrenadante, e 150 µL de Coomassie Brilliant Blue, de acordo com as instruções do fabricante. Nas mesmas condições, foi ainda efetuada uma curva de calibração para ambas as proteínas, utilizando 150 µL de uma gama de concentrações de 0; 2,5; 5; 10 e 15 µg/mL, e 150 µL de Coomassie Brilliant Blue. Após preparados os poços, as soluções resultantes foram incubadas durante 15 minutos à temperatura ambiente, e as absorvâncias a 595 nm lidas. Os dados foram tratados recorrendo ao software Excel, e a quantidade de proteína funcionalizada às AuNPs@PEG calculada através da curva de calibração polinomial de 3º grau (How to use a protein assay standard curve, Thermo Scientific - TECH TIP #57)
48 Procedeu-se ainda à obtenção do espectro de absorção das AuNPs@PEG@BSA e AuNPs@PEG@HEWL entre 400 a 800 nm por espectroscopia UV/visível, e para obtenção dos dados que permitiram a caracterização das partículas funcionalizadas com ambas as proteínas, o espectro foi normalizado a 400 nm.
Caracterização por DLS
Os conjuntos de AuNPs, AuNPs@PEG, AuNPs@PEG@BSA e AuNPs@PEG@HEWL foram caracterizadas por DLS (Dispersão Dinâmica de Luz, do inglês Dynamic Light Scattering), de modo a determinar os seus diâmetros hidrodinâmicos, e índices de polidespersão. A técnica de DLS foi levada a cabo no aparelho Nanoparticle Analyzer SZ-100 da Horiba Scientific, a uma temperatura de 25ºC, encontrando-se as amostras analisadas numa concentração de 2 nM (face às AuNPs), diluídas em água Mili-Q.