RNA de Camundongo
Para a extração do RNA total, os camundongos foram anestesiados com uretana (6L/g de peso corporal) e seguiu-se a retirada de sangue do plexo orbital. Após serem sacrificados, retirou-se por abertura da caixa torácica os seguintes órgãos: tecido adiposo branco epididimal, tecido adiposo marrom interescapular, fígado, fundo de estômago, baço, músculo gastrocnêmio, coração, artéria aorta, rim, hipotálamo. Todos os tecidos foram congelados imediatamente em nitrogênio líquido. Posterirormente, os tecidos foram homogenizados, separadamente, em presença de TRizol (Life Technologies) na proporção de 100 mg de tecido por mL de TRizol. Para a separação de proteínas, DNA e RNA presentes nos homogenatos dos tecidos, 200 l de clorofórmio por mL de TRizol utilizado foi adicionado. Essa mistura foi agitada por inversão por 15 segundos e centrifugada a 4000 giros por 15 minutos a 4 ºC. Após centrifugação, a fase superior que contém o RNA foi recolhida, sendo adicionado 500 L de isopropanol 99% por mL de TRizol, e novamente centrifugado por 20 min a 4°C. O RNA precipitado foi então lavado com etanol 70% preparado em H20 tratada com
dietilpirocarbonato 0,1% (H20 DEPC), seco a temperatura ambiente e ressuspendido
em água DEPC. A concentração de RNA foi medida por espectrofotometria e sua integridade avaliada em gel de agarose 1%.
Métodos
RNA Humano
Os tecidos coletados em cirurgia e imediatamente congelados, foram posteriormente homogeneizados em presença de TRizol (Life Technologies) na proporção de 100mg de tecido por mL de TRizol. Seguiu-se o mesmo protocolo de extração realizado nos tecidos de camundongo.
5. 1. 2 Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
O RNA extraído foi tratado com DNAse I (Invitroven) para excluir a presença de DNA genômico na amostra. Utilizou-se 1 g de RNA tratado com DNAse I para a reação de transcrição reversa (RT) com 1 L da enzima M-MLV RT (Invitrogen) a fim de se obter o cDNA. Adicionou-se à amostra 2 L de tampão de PCR (10x), 1,0 L de desoxirribonucleotídeos (dNTPs) na concentração de 10 mM, 1,0 L de MgCl2 (50 mM),
primers randômicos, para uma concentração final de 50 g, 40 unidades de RNAse OUT (inibidor de RNAse), e água DEPC completando 20 L em cada reação.
O programa realizado no termociclador (Eppendorf) consistiu em uma etapa de dez minutos mantendo as amostras a 20°C, seguida por 42°C, durante 45 min e 95°C por 5 min. Após a reação de obtenção do cDNA a partir do RNA extraído, as amostras foram mantidas a 4°C por 10 minutos.
Para a reação da polimerase em cadeia em tempo real, aproximadamente 900 g de cDNA foram utilizados. Ao cDNA foi adicionado 7,5 L de Master Mix 2x (Taq Man - Applied Biosystems), contendo dNTPs e DNA polimerase. Foram
associada a um fluoróforo FAM (5 M) específicos para B1 ou B2 ou GAPDH e água
milliQ autoclavada para completar 15 L de volume final. O programa utilizado consistiu em uma etapa de dois minutos a 50°C e dez minutos a 95°C. Posteriormente, eram feitos quarenta ciclos de 95 ºC por 15 segundos e 60 ºC por 1 minuto.
Para amplificação do cDNA correspondente ao receptor B1 e B2 utilizou-se
dois oligonucleotídeos específicos e uma sonda, também específica, marcada com o fluoróforo FAM e associada ao “quencher MGB”. Como controle endógeno foi realizado o mesmo protocolo com oligonucleotídeos e sonda específicos para o cDNA de - actina (para murinos) e GAPDH (para cDNA humano). O que diferencia essa técnica de um PCR comum é a presença de uma sonda complementar à seqüência do amplicon e que está associada a um agente fluorescente. Devido a atividade exonucleásica da DNA polimerase, a cada fragmento amplificado, uma molécula fluorescente é liberada no meio. Com isso, ciclo a ciclo, a intensidade de fluorescência pode ser medida pelo aparelho ABI 7000 (Applied Biosystems), correspondendo à quantidade de moléculas amplificadas e, proporcionalmente, ao número de cópias iniciais.
Esse método possibilitou a análise em tempo real da amplificação de um fragmento específico dos genes em estudo, permitindo a quantificação refinada da expressão do RNA mensageiro desses genes.
Os dados foram expressos como Ciclo limite (Ct ou “Cycle treshold”), ou seja, número de ciclos no qual a curva logarítmica de PCR cruza uma linha de corte arbitrariamente calculada. O cálculo da média do Ct da duplicata das amostras (Ct do gene alvo menos o Ct do gene normatizador) foi submetida a regressão linear.
Métodos O primeiro parâmetro utilizado é o valor de limiar da curva de amplificação obtida pela amplificação do cDNA de interesse (valor foi chamado de Ct). Houve a normalização dos valores subtraindo-se o Ct obtido da amplificação específica do receptor B1 do valor do controle endógeno, com obtenção do Ct. Devido à
característica logarítmica desse valor, houve utilização do parâmetro 2-Ct, para expressão dos dados em análises. O mesmo procedimento foi utilizado para a expressão do receptor B2 de cininas.
Para a amplificação de uma região específica dos genes dos receptores de cininas, oligonucleotídeos que são complementares a diferentes éxons desses genes foram utilizados. Posteriormente foi realizada a reação de transcrição reversa ou reação de polimerase em cadeia quantitativa (RT-PCR). Para a normalização da reação, bem como um controle da qualidade e quantidade de RNA utilizado, uma reação multiplex foi realizada, utilizando-se também oligonucleotídeos e sonda fluorescente específicos para genes endógenos.
Oligonucleotídeos e sonda para receptores de cininas murino no Real Time:
Oligo Forward: 5’-CCCTTCCTCTGGGTCCTCTT-3’
Oligo Forward: 5’-CCATACAAAACCCCAGCTGAA-3’
Receptor B1 Reverse: 5’-CTTTGGTTAGAAGGCTGTAGCTTCA-3’
Sonda: 5’-CACAGGAACCCAGACAG-3’
Oligo Forward: 5’-CCCTTCCTCTGGGTCCTCTT-3’
Receptor B2 Reverse: 5’-GAAGAACACGCTGAGGACAAAGA-3’
Sonda: 5’-CCGCACTGGAGAAC-3’
Oligonucleotídeo e sonda para actina (controle endógeno) de murino no Real Time:
Oligo Forward: 5’- CTGGCCTCACTGTCCACCTT-3’
actina Reverse: 5’- CGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3’
Sonda: 5’- CTGATCCACATCTGCT -3’
Oligonucleotídeos e sonda para receptores de cininas humano no Real Time:
Oligo Forward: 5’-ACCTCAGCCTCTCGAGTTGCT -3’
Receptor B1 Reverse: 5’-TGGTTGGAGGATTGGAGCTCTA -3’
Sonda: 5’-CTGTGCATGGCATCAT- 3’
Métodos Oligo Forward: 5’-CAGGATGTGAACCCAGTAGGACTAT -3’
Receptor B2 Reverse: 5’-AGCACTGAAGATGATTGGAGGATAC -3’
Sonda: 5’-TGCAAAGTCCCCACCC -3’
Oligonucleotídeos e sonda para GAPDH (controle endógeno) humana no Real Time:
Oligo Forward: 5’- GGGCAGCCCAGAACATCAT-3’
GAPDH Reverse: 5’- CCGTTCAGCTCTGGGATGAC-3’
Sonda: 5’- TTGGCAGCACCAGTGG -3’
5. 2 Western Blotting
Com intuito de se determinar a quantidade relativa e massa molecular dos receptores nos tecidos como fundus de estômago, aorta abdominal e tecido adiposo, foi realizada a técnica de Western Blotting.
Os tecidos utilizados foram retirados de camundongos C57Bl/6 selvagens e de mesma linhagem que não produzem leptina (ob/ob). Os animais foram sacrificados por decaptação, foi coletado o soro, e retirados os tecidos, sendo estes imediatamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados a - 80 C até a homogeneização.
Os tecidos foram então homogenizados em tampão RIPA (50mM de Tris-Hcl pH 6,8, 1mM EDTA, 1% NP40, 0,25% de deoxilato sódico, 150mM NaCl) e inibidor de protease. A concentração de proteína presente nos diferentes tecidos foi determinada utilizando-se um kit de reagentes da BIORAD, baseado na metodologia de Lowry e cols. (1951). Neste procedimento, 25 L da amostra a ser dosada foi colocada em contanto com 125 L de uma solução alcalina de tartarato de cobre (solução A da BIORAD) e 1000 L do reagente de Folin (solução B). A intensidade de absorbância da mistura resultante foi determinada a 750 nm, após 15 minutos de reação.
5.2.1 Eletroforese em gel SDS/Poliacrilamida
A eletroforese foi desenvolvida segundo o método descrito por LaemmLi (1970). Alíquotas de 50 µg de proteínas extraídas dos tecidos foram posteriormente adicionadas ao tampão de amostra (Tris-HCL 500 mM, pH 6.8, glicerol, SDS 10% (sódio dodecil sulfato- Sigma Co, EUA), -mercaptoetanol e bromofenol azul 0,05%. A seguir, as amostras foram aquecidas em banho seco, a 100 C, por 4 minutos. O mesmo procedimento foi empregado com as soluções padrão. As amostras assim preparadas foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida 13% sob uma tensão de 90 V.
5.2.2 Transferência e Revelação
Após a realização da eletroforese em gel de poliacrilamida 13% em presença de sulfato dodecil de sódio (SDS), foi realizada a transferência eletroforética (500mA, 60 minutos) das proteínas do gel de poliacrilamida para uma membrana de PVDF (Amersham Biosciences). A membrana contendo as proteínas transferidas foi
Métodos incubada com solução bloqueadora 5% de leite desnatado (Molico, Nestlé) em tampão Tris 200mM, pH 7,5, NaCl 500mM, contendo 0,1% de detergente Tween 20, durante 1 hora à temperatura ambiente. Posteriormente, realizou-se incubação overnight a 4 C, com o anticorpo policlonal (produzido em cabra) anti-B1 (1:1000) ou anti-B2 (1:1000)
sob agitação orbital fraca. Após a incubação com o anticorpo primário, a membrana foi lavada cinco vezes com tampão PBS-tween e incubada com o anticorpo secundário (1:2000) anti-cabra marcado com estreptavidina-peroxidase (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) por 3 horas sob agitação orbital fraca. A enzima ligada ao anticorpo secundário foi utilizada em conjunto com um agente quimioluminescente do kit ECL. A incubação com o kit proporciona uma reação, a qual produz fluorescência proporcional à quantidade de proteína ligada a membrana. Após 5 minutos de incubação da membrana com o kit realizou-se a revelação. Um filme fotográfico foi colocado contra a membrana permitindo que a exposição do filme à luz da reação criasse a imagem dos anticorpos ligados as respectivas proteínas. O filme foi posteriormente revelado e fixado.