4.3.1 Preparo do antígenos solúveis de promastigotas de Leishmania infantum A preparação de antígenos solúveis de promastigotas de Leishmania infantum teve por objetivo a realização dos ensaios de avaliação de resposta imune específica. Esse antígeno foi obtido através de métodos previamente descritos (SOUZA et al., 2004), com algumas modificações. Resumidamente, formas promastigotas de L. infantum, isolada de caso confirmado de LV (IOC3052), foram cultivadas em meio Schneider até atingir a fase estacionária. Posteriormente, essa cultura foi ajustada para a concentração de 107 promastigotas/mL e centrifugada à
2.500 x g por 10 minutos a 4ºC. Foi então lavada 3 vezes com salina estéril seguida de uma última centrifugação à 2.500 x g por 10 minutos à 4°C. O sedimento foi suspenso em solução tamponada salínico fosfatada (PBS) estéril e acrescido de inibidores de proteases (PMSF e leupeptina), sendo submetido a congelamento- descongelamento (3 vezes), seguido de centrifugação. O sobrenadante continha a fração solúvel de antígenos. A concentração de proteína foi mensurada através do Kit para detecção de proteína com ácido bicinconínico (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA), e a solução estoque de proteína mantida a -80º C.
4.3.2. Avaliação dos níveis de anticorpos anti-leishmânia utilizando antígenos recombinante K39 (rK39) e antígeno solúvel de Leishmania infantum (SLA).
Anticorpos anti-leishmânia foram quantificados pelo método ELISA, seguindo protocolo previamente descrito, mas com algumas modificações (BRAZ et al., 2002). Em resumo, placas de 96 poços (Linbro, Ohio, EUA) foram sensibilizadas com 50 ng/poço de antígeno rK39 (Infectious Diseases Research Institute, Seattle, WA) e 500 ng/poço de antígeno solúvel de L. infantum (SLA), sendo incubadas por 18 horas a 4ºC. Ambos os antígenos foram diluídos em tampão carbonato-bicarbonato (15mM Na2CO3, 34mM NaHCO3, pH 9,6). Em seguida, as placas foram bloqueadas, adicionando-se solução de PBS–Tween-20 1% em PBS (200 µL/poço) e incubadas à temperatura ambiente por 1 hora.
Os soros foram diluídos, em solução de PBS-Tween-20 0,1% na diluição 1:100 (rK39) ou 1:500 (SLA). Após o bloqueio, as placas foram lavadas por 4 vezes com solução de lavagem (Tween-20 diluído 0,1% de PBS) (200 µL/poço). Os soros dos pacientes foram então plaqueados, em duplicata, e encubados 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas por 4 vezes com tampão de lavagem. Foi adicionado o anti-IgG humana (Promega, EUA), diluído em tampão de lavagem, na diluição 1:5000. Após 1 hora, as placas foram lavadas novamente em tampão de lavagem. Em seguida, foi adicionado o cromógeno ABTS e substrato H2O2 (100
µL/poço) diluídos em tampão citrato-fosfato pH 4,2. A placa foi encubada ao abrigo da luz por 2 horas até a reação ser interrompida pela adição de 100 µL/poço de SDS 5%. A densidade óptica utilizada para leitura foi de 405nm (Biochrom®, Asys expert plus, Cambridge, UK).
4.3.3 Estimativa da carga parasitária por PCR quantativo
Foi utilizado PCR quantitativo conforme já publicado (WEIRATHER et al., 2011). DNA de sangue periférico foi isolado conforme descrito por Bellus (BELLUS et al., 1995). Em resumo, foi adicionado ao sangue previamente homogeneizado 35 mL de tampão de lise de células vermelhas (bicarbonato de amônio 0,88 mM, cloreto de amônia 131mM) para cada 10 mL de sangue. A amostra foi então incubada em gelo por 30 min, seguido de centrifugação a 2000 g (Beckman Coulter GS6R, Califórnia, EUA) por 15 min à 10ºC. Após centrifugação o sobrenadante formado foi desprezado. Foram então adicionados 5 mL para cada 10 mL de sangue de tampão de lise de células brancas (Tris 1M, pH = 8,5, EDTA 0,25M, SDS 10%) e a amostra homogeneizada. Posteriormente foram adicionados 2,5 mL de acetato de amônio 5 M, para cada 10 mL de sangue. A amostra foi então centrifugada 2000 g à 25ºC por 30 min. O sobrenadante foi transferido para tubo de centrífuga de 50 mL e adicionado 8mL de solução de precipitação de DNA (isopropanol) e homogeneizado gentilmente por inversão. O DNA precipitado foi então coletado e lavado com 200µL de etanol 70%, mantido à temperatura ambiente até completa evaporação do etanol. O precipitado foi então ressuspenso em 500 µL de água Milli Q. O DNA foi quantificado por Nanodrop e utilizado para avaliação da presença de DNA de Leishmania spp. usando os iniciadores descritos abaixo. Os resultados foram expressos como parasitas em 80ng∕DNA.
Tabela 2. Sequência de iniciadores e sonda usados na identificação de Leishmania spp. através do PCR quantitativo.
MAG-1 Senso: 5’ - AGAGCGTGCCTTGGATTGTG-γ’
Anti-senso: 5’- CGCTGCGTTGATTGCGTTG-γ’
Sonda
MAG1 5’- TGCGCACTGCACTGTCGCCCCC
KDNA-7 Senso: 5’ -AATGGGTGCAGAAATCCCGTTC-γ’Anti-senso: 5’-CCACCACCCGGCCCTATTTTAC -γ’
onda
KDNA-7 5’- FAM –CCCCAGTTTCCCGCCCCGGA
Para confecção da curva padrão, o DNA foi extraído de cultura de formas promastigotas de Leishmania donovani. Foi realizada, então, uma diluição seriada do DNA correspondendo à 106 parasitas por mL até 10-3 parasitas por mL. A reação
de PCR quantitativo foi feita em um volume final de 10μl, composto de 5 µL de 2x taqman (Applied Biosystems, EUA) e 200 nmol de cada primer e 80ng de DNA. O DNA foi amplificado seguindo o seguinte parâmetro: 50ºC por 2 minutos, 95ºC por 10 minutos e um total de 40 ciclos com temperaturas variando de 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto, a cada ciclo. Cada reação de PCR foi feita em triplicata. Foram consideradas positivas para PCR quantitativo apenas amostras que amplificaram antes de 30 ciclos, como previamente descrito (WEIRATHER et al., 2011).
Encontramos correlação positiva, avaliando os indivíduos dos grupos LV ativa, Curado 4 meses, Curado 14 meses, Controle Positivo e Controle Negativo, tanto nos níveis de IgG usando os antígenos SLA e rK39 (r=0,780; p<0,0001), quanto na avaliação da parasitemia usando iniciadores KDNA-7 e MAG-1 (r=0,738; p<0,0001) (Figura 4). D e n s i d a d e ó p t i c a 4 0 5 n m ( I g G a n t - r K 3 9 ) D e n s id a d e ó p ti c a 4 0 5 n m (I g G a n t- S L A ) 0 1 2 3 4 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0 2 .5 r = 0 ,7 8 0 p < 0 ,0 0 0 1 Q u a n tid a d e d e L e is h m a n ia e m 8 0 n g d e D N A (K D N A -7 ) Q u a n ti d a d e d e L e is h m a n ia e m 8 0 n g d e D N A ( M A G -1 ) 0 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 4 0 0 0 5 0 0 0 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 r = 0 ,7 5 7 p < 0 ,0 0 0 1
Figura 4. Correlação entre os níveis de IgG anti-rK39 e anti-SLA e parasitemia KDNA-7 e Mag-1 no sangue periférico dos indivíduos dos grupos LV ativa, curados e controles. Correlação entre a os níveis de IgG detectada no soro utilizando antígenos rK39 e antígenos SLA. Correlação entre a quantidade de parasitas detectada no sangue periférico utilizando iniciadores KDNA-7 e MAG-1. Cada círculo representa um controle e o quadrado representa um paciente. A linha obliqua representa a linha de tendência.
A B
4.4 AVALIAÇÃO DA QUANTIDADE SÉRICA DE TRANSAMINASES TGO E TGP, E