Para manter os níveis intracelulares de zinco relativamente constantes, o ponto primário desse controle na levedura S. cerevisiae é a regulação da captação do zinco através da membrana plasmática. Tanto em S. cerevisiae quanto em outros eucariotos, a principal família de transportadores envolvidas no processo de captação de zinco é a família ZIP, que leva esse nome devido aos primeiros membros identificados ‘ZRT, IRT-like Protein’. Essa família é composta por proteínas Zrt (zinc-regulated transporter) presentes inicialmente em S. cerevisiae e também por proteínas Irt (iron-regulated transporter) presentes na planta Arabidopsis thaliana (GUERINOT, 2000).
A característica principal da família ZIP é que, sem exceções ainda conhecidas, essas proteínas transportam zinco e/ou outros metais do meio extracelular ou compartimentos celulares para dentro do citoplasma. Além disso, já foram encontradas em bactérias, fungos, plantas e mamíferos (EIDE, 2009).
A maioria das proteínas ZIP é descrita como tendo oito domínios transmembranares e uma topologia de membrana similar, na qual cada extremidade amino-terminal e carboxi-terminal estão localizados no lado de fora da membrana plasmática. Na maioria dos casos, essas proteínas apresentam uma região variável rica em histidina localizada entre os domínios transmembranares 3 e 4. A função dessa região ainda é desconhecida, mas acredita-se que tenha uma função no transporte e regulação do zinco (figura 6) (EIDE, 2009; GUERINOT, 2000).
A atividade de captação do zinco em leveduras é mediada por dois sistemas que utilizam proteínas membros da família ZIP: (1) um sistema de alta afinidade ao zinco, cujo transportador é codificado pelo gene ZRT1 e (2) um sistema de baixa afinidade ao zinco, cujo transportador é codificado pelo gene ZRT2 (EVANS-GALEA et al., 2002; ZHAO et al., 1998).
Figura 6 - Topologia predita para os transportadores da família ZIP. A topologia predita sugere a presença de oito domínios transmembranares (1-8). A região variável se encontra entre os domínios 3 e 4, a qual possui uma região rica em histidina com função ainda não totalmente elucidada. Fonte: Adaptado de EIDE, 2009.
Em S. cerevisiae a proteína Zap1 é o principal atuante nesse sistema de homeostase (EIDE, 2009; FREY; EIDE, 2012; ZHAO et al., 1998). Zap1 é um fator de transcrição, que atua na regulação da expressão de mais de 80 genes em células com limitação de zinco. Além dos genes ZRT1 e ZRT2, Zap1 regula outro gene que codifica proteínas transportadoras de membrana, o FET4; além de genes que codificam proteínas transportadoras vacuolares de zinco (ZRT3 e ZRC1), e genes que codificam outras proteínas importantes na regulação dos níveis de zinco (FREY; EIDE, 2012). Os genes ZRT1 e ZRT2 codificam transportadores de Zn2+, enquanto que FET4 codifica transportadores de Fe2+, Cu2+ e Zn2+. ZRT1 e ZRT2 têm um papel no transporte de metal em bactérias, fungos, plantas e animais, sendo que ZRT1 tem a maior afinidade por zinco e é fundamental em condições extremas de limitação de zinco nas células (EIDE, 2009).
O gene ZRT1 é expresso em um maior nível quando a célula está em uma situação na qual a concentração de zinco é muito baixa. Isso ocorre porque Zrt1 é uma proteína transportadora com papel fundamental no fornecimento de zinco quando a célula encontra-se nessas situações extremas, enquanto que Zrt2 tem um papel de manutenção das condições celulares (ZHAO et al., 1998).
Na maioria desses genes, a Zap1 atua como um ativador transcricional e aumenta a sua expressão quando os níveis de zinco estão baixos (EIDE, 2009).
Para exercer tais funções Zap1 se liga aos elementos de resposta ao zinco (ZREs –
zinc-responsive elements), também chamados de elementos de resposta a metais
(MREs – metal-responsive elements), presentes nos promotores dos genes em questão (EIDE, 2009; ZHAO et al., 1998).
Os promotores dos genes regulados pela Zap1 podem conter uma ou mais cópias dos MREs, que apresentam uma sequência consenso de 11pb (5' -
ACCnnnAAGGT - 3') (EVANS-GALEA et al., 2002). O gene ZRT1 apresenta três cópias desses MREs, e o gene ZRT2 apresenta duas cópias (ZHAO et al., 1998).
Algumas características desses MREs foram identificadas por Zhao et al., (1998), sendo elas: (1) os MREs são necessários e suficientes para a expressão dos genes responsivos ao zinco; (2) MREs podem funcionar em qualquer orientação em relação ao local de início da transcrição; (3) MREs sozinhos também são ativos, ou seja, múltiplas cópias não são necessárias para a sua função; (4) quando esses elementos estão presentes em múltiplas cópias em um promotor, eles são aditivos ao invés de cooperativos em seus efeitos.
O zinco intracelular fica armazenado no vacúolo e quando a célula está sob condições normais de disponibilidade de zinco, a quantidade do metal acumulada é suficiente para suprir as necessidades celulares. A partir do momento que essa disponibilidade de zinco diminui, o gene ZRT3 é ativado pela Zap1 e desempenha o papel de transportar o zinco do vacúolo para o citoplasma, no qual ele se torna disponível para ser utilizado (Figura 7) (EIDE, 2009).
Quando a concentração de zinco se torna mais limitante, é necessário que ocorra a ativação do gene ZRT1. Nessa situação a proteína ativadora Zap1 se liga aos MREs do promotor de ZRT1 e ativa a sua transcrição, tornando possível a captação extracelular do zinco através da membrana plasmática, aumentando o nível intracelular de zinco. Quando a deficiência de zinco for suprida, o próprio metal irá inativar o sistema de ativação de ZRT1, impedindo que a Zap1 se ligue aos MREs do promotor (Figuras 7 e 8) (EIDE, 2009; ZHAO et al., 1998).
Para entender a interação da Zap1 com os MREs, primeiramente é necessário entender a estrutura dessa proteína. Zap1 é um fator de transcrição de 93 kDa (EVANS-GALEA et al., 2002), com uma cadeia composta por 880 aminoácidos, cujo domínio de ligação ao DNA se encontra na porção C-terminal. Esse domínio é composto de cinco motivos dedos-de-zinco (Znf3 a Znf7), essenciais para a função da proteína (EIDE, 2009; EVANS-GALEA et al., 2002; FREY et al.,
2011; ZHAO et al., 1998) (Figura 9). No entanto, acredita-se que esses cinco motivos não apresentem a mesma importância no contato com o promotor, ou seja, somente um subconjunto desses motivos é responsável pelo contato com os MREs (EVANS-GALEA et al., 2002).
De acordo com Evans-Galea et al., (2002) quatro dos cinco motivos dedo-de- zinco presentes no domínio DBD são responsáveis pela ligação da Zap1 aos MREs, sendo que o motivo Znf3 não apresentou papel algum nessa função. Os motivos Znf4 e Znf7 são os principais atuantes nessa função, ligando-se as extremidades da sequência consenso (ACC-GGT). Os estudos revelaram que Znf7 se liga na sequência ACC, Znf4 na sequência GGT e Znf5 e Znf6 se ligam nos 5bp centrais da sequência (nnnAA) (Figura 10).
Figura 7 - Respostas à deficiência de zinco mediada por Zap 1 em S. cerevisiae. A figura representa a localização e a resposta dos genes responsáveis pelo transporte de zinco para o citoplasma quando a célula está em condições de limitação de zinco. Fonte: BORGES, F. G. (2015) (adaptado de EIDE, 2009).
Figura 8 - Mecanismo de ativação do gene ZRT1 pela Zap1 em S. cerevisiae. Quando a concentração de zinco intracelular está normal ou alta, os MREs do promotor do gene ZRT1 permanecem livres. A partir do momento que a concentração de zinco diminui, a proteína ativadora Zap1 se liga aos MREs e ativa a transcrição do gene. Fonte: BORGES, F. G. (2015) (adaptado de EIDE, 2009).
Figura 9 - Anatomia do fator de transcrição Zap1. O domínio de ligação ao DNA (DBD) com os cinco motivos dedo-de-zinco (3 a 7) representados pelas caixas pretas. O domínio AD1 representado pela caixa listrada e o domínio AD2, representado pela caixa listrada, com seus dois motivos dedo-de-zinco (1 e 2) representados pelas caixas pretas. Fonte: BORGES, F. G. (2015) (adaptado de EIDE, 2009).
Figura 10. Ligação dos motivos dedo de zinco no Elemento de Resposta a Metais (MRE) em S. cerevisiae. Os motivos Znf4 e Znf7 se ligam as sequência da extremidade e os motivos Znf5 e Znf6 se ligam aos 5 bp centrais. Fonte: EVANS-GALEA et al., 2002.
Além do domínio de ligação ao DNA, Zap1 apresenta outros dois domínios, AD1 e AD2, também responsáveis pela ativação da transcrição em resposta a baixa concentração de zinco. O domínio AD1 encontra-se na porção N-terminal da proteína, entre os resíduos 332 e 402, e incorporado em uma região chamada de ZRDAD1 (Zinc-Responsive Domain of AD1), necessária para a regulação por zinco. O domínio AD2 está localizado aproximadamente entre os resíduos 611 e 641 e a região chamada ZRDAD2 inclui dois motivos dedo-de-zinco (Znf1 e Znf2) (Figura 9) (EIDE, 2009, FREY et al., 2011).
Sendo assim, sob limitação de zinco, a proteína Zap1 se liga aos MREs dos promotores e regula a transcrição, permitindo uma forte resposta às condições limitantes de zinco (CLAUS; CHAVARRÍA-KRAUSER, 2012).
Estudos sugerem que a Zap1 é um sensor direto de zinco e encontra-se no núcleo das células sob todas as condições de zinco disponível. O zinco regula a atividade da Zap1 por diferentes mecanismos. Esses mecanismos envolvem os domínios AD1 e AD2, sendo controlados pelo zinco de forma independente. Quando o nível de zinco aumenta, o metal se liga aos resíduos das regiões de AD1 e AD2. Essa ligação traz modificações conformacionais que torna os domínios inativos, sendo incapazes de recrutar co-ativadores da Zap1, inibindo a sua atividade (EIDE, 2009, FREY et al., 2011).