Os trabalhos iniciaram em julho de 2007 com a colaboração da Secretaria Municipal de Educação (SME) através do levantamento dos escolares na faixa etária de cinco a 15 anos, matriculados na rede municipal e estadual de ensino. O município dispunha de 13 escolas municipais e cinco estaduais, das quais duas localizadas na área urbana e as demais distribuídas na área rural. Foi constatado um contingente de 2.363 alunos matriculados, onde 1.971 escolares pertenciam a faixa etária escolhida para este estudo.
3.4.1. Cálculo da amostra
A amostra estudada foi calculada segundo as normas técnicas para realização de inquérito sorológico destinados à avaliação do PCDCh publicada pelo MS (1994). Para o cálculo do tamanho da amostra foram utilizados três parâmetros: (1) proporção de indivíduos na faixa etária estudada infectada pelo T. cruzi, no Inquérito Sorológico Nacional de 1975 a 1980; (2) erro aceitável de 5% e (3) número de escolares da zona rural do município.
Como não tínhamos dados que nos reportassem ao primeiro parâmetro utilizamos a proporção entre 41-50% considerando que neste intervalo a amostra era maior, conforme recomendado pelo MS, porém para trabalharmos com uma margem de segurança maior a amostra foi aumentada em 50% do valor estimado inicialmente.
Para a seleção das crianças a serem submetidas à coleta de sangue foi confeccionada uma listagem onde as crianças foram estratificadas por escola e idade, e cada criança recebeu um número. Foi também realizado um cálculo para estimar o número de crianças por faixa etária e por escola que deveriam ser submetidas à coleta, conforme recomendações do MS. Utilizando o programa estatístico Epi Info 6.0 foi realizado um sorteio aleatório simples para compor a amostra a ser estudada. Desta forma, a amostra encontrada para estudo foi de 603 indivíduos (Tabela 1).
45 Tabela 1 – Estratificação da amostra (1ª Etapa – Inquérito Sorológico) por escola e idade, apresentado por unidade escolar, município de Açucena, Vale do Aço, Minas Gerais.
Nome da Escola Estratificação por idade
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 n n*
E.M. Geraldo Luiz do Nascimento 4 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 10 E.M. de Coqueiros 0 1 1 3 2 2 4 3 2 1 1 20 20 E.M. Anselmo Garito 0 0 0 0 1 2 2 0 0 0 0 5 5 E. M. São Joaquim 0 0 1 1 2 1 1 1 1 0 0 8 8 E.M. Said Farah 0 0 2 4 2 3 0 1 0 0 0 12 12 E.M. de São Francisco 0 0 0 2 2 3 1 0 1 0 0 9 9 E.M. Vitor de Amorim 0 1 1 2 2 4 3 1 1 0 1 16 20 E.M. Pe Jose Maria 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 5 5 E.M. Dahir Siman 0 1 3 2 3 1 2 0 0 0 0 12 12 E.M. Pe Felix 0 2 7 7 8 9 7 8 7 6 3 64 65 E.M. de São Pedro 0 3 2 3 1 2 2 2 2 5 1 23 23 E.M. Agnelo Barbosa 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 5 5 E.M. Penha do Aramirim 0 1 5 5 3 6 5 6 4 7 1 43 43 E.E. Odete Valadares 0 1 3 5 3 4 6 9 9 12 7 59 60 E.E. De Naque Nanuque 0 3 6 8 7 10 8 12 10 9 3 75 85 E.E. Dom Serafim Gomes Jardim 0 1 2 2 1 2 2 3 2 3 1 19 19 E.E. Cristiano Machado 0 1 6 3 4 5 6 4 8 7 2 46 50 E.E. Antonio Alticiano (Sede) 0 6 13 13 14 20 21 25 18 24 17 171 184
Total 4 27 54 62 57 76 72 75 65 74 36 603 638
Legenda: E.M. = Escola Municipal; E.E. = Escola Estadual; n = número de coletas calculadas; n* = número de coletas realizadas.
As crianças ausentes ou cujos pais não concordaram com a realização da coleta foram substituídas pelas subsequentes existentes na listagem dos alunos, preservando assim a amostra e a estratificação por idade. Foram ainda incluídas na amostra mais 35 crianças por solicitação dos pais.
O inquérito sorológico se deu em duas etapas. Na primeira etapa foi feita uma triagem onde a sorologia foi realizada em amostras de sangue coletado em papel de filtro. A segunda etapa consistiu na realização de testes sorológicos em amostras de sangue venoso de todos escolares considerados positivos, inconclusivos e em 10% dos negativos revelados na etapa anterior.
Todas as etapas de coleta de sangue foram precedidas de orientações aos pais ou responsáveis e de assinatura por estes dos Termos de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo 1 e Anexo 2).
46 O projeto foi previamente submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), protocolo Nº 011.0.238.000-07 atendendo a Resolução nº196/96, do Conselho Nacional de Saúde do Ministério da Saúde do Brasil, respeitando os preceitos e normas de pesquisa envolvendo seres humanos.
3.4.2. Triagem sorológica em papel de filtro – 1ª Etapa
Esta etapa considerada como uma triagem inicial teve como objetivo identificar indivíduos que poderiam ser portadores da DCh. Para a realização da triagem sorológica contamos com o apoio da SME de Açucena que encaminhou aos pais dos alunos selecionados o TCLE-1 (Anexo 1) a ser assinado por eles para que as crianças pudessem participar do inquérito. A coleta de amostras foi realizada no período de 16/10/2007 a 05/12/2007.
Devido à extensão territorial do município, às grandes distâncias entre as escolas e a sede do município, a má qualidade das estradas e ao número elevado de coletas por unidade escolar, optou-se por realizá-las nas próprias escolas. A prefeitura auxiliou no deslocamento da equipe de pesquisadores até as localidades das escolas.
O sangue para realização da sorologia inicial foi colhido em tiras de papel filtro Whatman nº4 obtido da polpa digital. Para sua coleta foram utilizadas microlancetas estéreis e descartáveis. Para cada criança foram coletadas duas amostras de sangue espalhadas em uma área de aproximadamente dois centímetros de diâmetro na tira de papel dispostas no espaço lateral ao da identificação da amostra.
Cada criança recebeu um número de identificação de acordo com a ordem de entrada no inquérito e este número foi utilizado para a identificação da amostra de sangue coletada. As tiras de papel de filtro continham as seguintes informações: número de identificação da amostra; nome da criança; nome da escola e a série que a criança cursava.
Posteriormente à coleta, os papéis foram secados à temperatura ambiente afixados em dispositivo adequado para que não ocorresse contato entre as tiras de papel de filtro. A seguir os papéis eram acondicionados em sacolas plásticas
47 hermeticamente fechadas, contendo sílica gel para preservação das amostras. As amostras foram separadas, embaladas e identificadas por escola. Após a realização dos exames as amostras foram armazenadas em geladeira a 4ºC para preservação caso fosse necessário repetir alguns dos exames.
O material coletado em papel de filtro foi então submetido à análise através do método de ELISA “in house” (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) padronizado pelo Laboratório de Doença de Chagas da UFOP no período de 17 a 21/12/2007.
3.4.3. Sorologia confirmatória – 2ª Etapa
Foram submetidos à sorologia confirmatória todos os indivíduos considerados positivos, os que tiveram resultados na faixa considerada zona cinza e 10% dos negativos selecionados aleatoriamente.
Para a sorologia confirmatória foi encaminhado, aos pais das crianças ou responsáveis outro TCLE-2 (Anexo 2) a ser assinado por eles para que as crianças pudessem continuar a participar da segunda etapa do inquérito.
Nesta segunda fase da pesquisa a coleta de sangue foi feita por punção venosa utilizando o sistema vacuntainer. Foi coletado um volume de três a cinco mililitros de sangue. As amostras de sangue foram submetidas à centrifugação a 3000 rotações por 10 minutos. Os soros obtidos foram armazenados em tubos eppendorf previamente identificados e mantidos à temperatura de -20º C em freezer até a realização dos exames.
Para a realização desta etapa do trabalho foi utilizado um posto de coleta na sede do município de Açucena cedido por um laboratório de análises clínicas da região. Mais uma vez contamos com o apoio da SME que providenciou o transporte das crianças e seus responsáveis até o posto o que proporcionou ganho de tempo para realização das coletas e mais segurança no processo. Estas coletas tiveram início em 05/05/2008 e finalizaram 21/08/2008.
O soro foi inicialmente submetido a exames pelas técnicas de ELISA “in house” e Hemaglutinação Indireta (HAI). Os resultados inconclusivos foram submetidos a uma terceira técnica sorológica, a IFI, seguindo assim o recomendado pelas Normas Técnicas do MS aplicadas a Inquéritos Sorológicos destinados à Avaliação do PCDCh e pela OMS (WHO, 1991; MS, 1994). As amostras que não
48 apresentaram resultados conclusivos com o exame de IFI foram submetidas ainda à técnica de ELISA recombinante (ELISA-rec).
Nesta segunda etapa os casos foram considerados positivos, negativos e inconclusivos após avaliação concomitante de duas, três ou quatro técnicas sorológicas para DCh. Foram considerados positivos indivíduos que apresentaram reatividade em duas técnicas; negativos aqueles que não apresentaram reatividade em pelo menos duas técnicas; e inconclusivos os indivíduos que apresentaram resultados discordantes ou duvidosos entre as técnicas realizadas.
3.5. Métodos de diagnóstico sorológico empregados