Tabela 9: Valores dos rendimentos dos isoxazóis alquilados
Comp. R R1 R2 Rend.(%) Comp. R R1 R2 Rend.(%)
45a 4-MePh H H 55,4 45m 4-OMePh Cl Cl 100,0
45b 4-OMePh H H 62,5 45n Ph Cl H 79,2 45d 4-ClPh H H 88,8 45o 4-OMe Cl H 32,0 45e 4-FPh H H 27,8 45p 4-FPh Cl H 85,0 45f 3,4,5- (OMe)3Ph H H 78,7 45z 3-NO2Ph OMe H 63,1 45g Furano H H 60,5 46f 3,4,5- (OMe)3Ph H H 72,1 45h 3-NO2Ph H H 75,7
77
O isoxazol 44c foi alquilado, porém, sua purificação por coluna cromatográfica em sílica gel não foi possível, pois, a proporção isomérica antes da alquilação era praticamente 1:1, e o mesmo aconteceu na alquilação, dificultando bastante a purificação.
Apesar dos dois isômeros de todos os isoxazóis terem sidos alquilados, um sempre proporcionou maior rendimento sobre o outro, e esse foi escolhido como produto de interesse.
A primeira característica física que mostrou o sucesso da alquilação, foi a diminuição drástica do ponto de fusão, assim como o aumento nos valores de Rfs, que indicaram a formação de substâncias menos polares.
Os isoxazóis alquilados (45a, 45b, 45d a 45h, 45m a 45p, 45z e 46f) foram caracterizados por espectros de massas, de IV, de RMN ¹H e de ¹³C. O composto
46f foi o único alquilado com iodo metano.
No espectro de RMN ¹H (Figura 28) do composto 45b o aumento de sinais na região de hidrogênios aromáticos, bem como, a ausência do simpleto desblindado relativo ao grupo hidroxílico e um simpleto em 5,3 ppm (H-17) referente a dois hidrogênios em campo alto (-CH2O-) foram coerentes com a estrutura proposta para
o composto.
78
No espectro de RMN ¹³C (Figura 29) o sinal em 70,7 ppm (C-14) confirmou a formação do produto, assim como, aumento de sinais na região de carbonos aromáticos.
Figura 29 – Espectro de RMN ¹³C 5-(2-(benziloxi)fenil)-3-(4-metoxifenil)isoxazol em CDCl3 em
aparelho de 100 MHz
No espectro no IV (Figura 30) do composto 45b, a grande intensidade da banda em 1600 – 1500 cm-1 correspondem ao estiramento C=C de aromático. As duas bandas
que aparecem em 1250 e 1022 cm-1, correspondem ao éter aromático formado na alquilação. ISO28F 4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 100 95 90 85 80 75 Wavenumber % Tr an sm itt an ce
Figura 30 – Espectro no IV do composto 45b
1600
1250 1022
79
Na Tabela 10 são apresentados os dados para as caracterizações realizadas para os demais isoxazóis 3,5-dissubstituídos.
Tabela 10 – Caracterizações dos isoxazóis alquilados
Compostos Massas (m/z) RMN ¹H (H-14) (ppm) RMN ¹³C (C-14) (ppm) IV (cm-1) (C-O-Céster arom.)
45b 357 (M+, 10%); 91 (100%) 5,28 70,74 - 45d 361 (M+, 5%); 91 (100%) 5,28 70,79 - 45e 345 (M+, 10%); 91 (100%) 5,28 70,77 - 45f 312 (100%); 297 (50%) 5,22 70,74 1140 e 1000 45g 317 (M+, 10%); 91 (100%) 5,29 70,67 1260 e 1020 45h 372 (M+, 5%); 91 (100%) 5,30 70,93 - 45m - 5,03 55,38 1230 – 1020 45n - 5,24 70,09 1240 e 1020 45o - 5,22 71,06 1250 e 1020 45p - 5,21 71,10 1240 e 1020 45z - 5,29 76,44 1230 e 1070
Com exceção do composto 45f, todos os isoxazóis tiveram os picos dos íons moleculares presentes nos espectros de massas. Eles sofrem a mesma fragmentação por uma clivagem heterolítica formando o íon tropílio.
80 6 TESTES BIOLÓGICOS
6.1 Avaliação da atividade anti-chagásica
Em uma triagem inicial os compostos 44c; 44d; 44e, 44g; 44h, 44m, 45f, 45g e 45m foram selecionados para serem submetidos ao teste antichagásico. Esses testes foram realizados no Laboratório do Centro de Pesquisas René Rachou/CPqRR -- A Fiocruz em Minas Gerais, pelo doutor Policarpo Ademar Sales Junior.
Os métodos utilizados para realizar esse teste biológico estão disponíveis nos anexos.
6.1.1 Resultados
Os resultados do teste anti T.cruzi foram expressos pela atividade (%) dos compostos na redução das formas amastigotas e tripomastigotas; IC50 sobre o
parasito (µM) concentração dos compostos que reduz em 50% o crescimento parasitário; IC50 sobre as células (µM) concentração dos compostos que induz 50%
de morte celular de fibroblastos de camundongos e a seletividade que é calculada pelo IC50 dos compostos sobre as células dividido pelo IC50 dos compostos sobre o
parasita. Os resultados são apresentados na Tabela 11.
Quanto menor a concentração do composto para reduzir em 50% o crescimento dos parasitos melhor é o efeito medicinal da molécula. O ideal é que os compostos testados apresentem índice de seletividade maior que 50, para serem conduzidos para o teste in vivo.
81
Tabela 11– Resultados da atividade antichagásica de alguns isoxazóis 3,5-dissubstiuídos para as formas amastigota e tripomastigota do T.cruzi
Composto IC50 sobre o parasita (M) IC50 sobre as células (M) Índice de Seletividade N O OH 9,48 >18,90 > 2 N O OH Cl 4,87 10,80 2,2 N O OH F >20,46 >20,00 3,6 N O OH O 7,06 9,00 2,4 N O OH NO2 4,56 16,60 1,4 N O OH O Cl Cl 4,70 6,70 < 1 N O O Ph O O O 6,96 16,60 - N O O Ph NO2 >30,00 29,80 -
82 N O O O Cl Cl Ph >34 - 1,3 N O O O O O 3,37 13,64 4,0 Benzonidazol 3,81 M 2.381 M 625
Os compostos 44c; 44d; 44g; 44h; 44m; 45f; e 46f foram ativos e pouco seletivos, pois seus valores foram inferiores ao do padrão utilizado. O composto 44c, sem substituintes, foi o que apresentou o menor efeito tripanocida se comparado com os outros considerados ativos, sugerindo a importância da variação estrutural a partir de substituintes nas moléculas. O composto 46f (3,37 M) foi o que apresentou o melhor efeito, até mesmo do que o benzonidazol, provavelmente os quatro grupos metoxilas presentes nas estruturas são responsáveis pela inibição da reprodução das formas amastigota e tripomastigota do parasito, pois quando comparado com seu análogo benzilado 45f (6,96 M) o efeito tripanocida foi mais baixo. Os compostos 44h (4,56 M); 44m (4,70M); 44d (4,87 M) e 44g (7,06 M) foram ativos, porém apresentaram uma concentração ligeiramente maior que a do benzonidazol. Elas apresentam em suas estruturas grupos NO2; 3,5-Cl e 4-
OCH3; 4-Cl; furano, respectivamente. Assim, uma relação estrutura-atividade não
pode ser afirmada. Porém, o que chama a atenção é o composto 44h, o qual possui em sua estrutura o grupo nitro, o mesmo presente no Benzonidazol, responsável pelo efeito tripanocida.
Nesta triagem inicial nossa intenção era avaliar se essa classe de moléculas apresentaria algum potencial antichagásico. Como se trata de um estudo inicial, o mecanismo de ação dos compostos testados não foi avaliado. Pelos resultados obtidos, pôde-se concluir que esses compostos não alquilados apresentam maior potencial antichagásico, evidenciando a importância das hidroxilas nessas moléculas.
83 6.2 Introdução: Avaliação da atividade antimicrobiana
Vários compostos de origem sintética possuem atividade direta contra muitas espécies de bactérias, aumentam a atividade de um antibiótico específico, invertem a resistência natural de bactérias específicas a determinados antibióticos, promovem a eliminação de plasmídeos a partir de bactérias e inibem a função de transporte da membrana plasmática.60
Em todo o mundo, há um grande número de cepas bacterianas resistentes a múltiplas drogas, principalmente no ambiente hospitalar, aumentando a morbidade, custos inerentes a cuidados de saúde, e as taxas de mortalidade devido a infecções.59
Os compostos isoxazolínicos podem ser considerados agentes antimicrobianos em potencial, uma vez que relatos na literatura confiram tal fato. Nessa perspectiva, a pesquisa de novos produtos sintéticos com ação antimicrobiana ou que atuem no controle da resistência bacteriana, torna-se uma alternativa relevante.
Em uma triagem inicial, os compostos (44a, 44b, 44c, 44e, 44f, 44g, 44h, 44j,
45a, 45b, 45e, 45h, 45n, 45o, 45p e 46f) foram submetidos a testes de atividade
antimicrobiana e antifúngica, como será descrito adiante. Esses testes foram realizados no Laboratório de Microbiologia da Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto.
Ensaio
Linhagens celulares
Foram utilizados 5 microrganismos de coleções padrões da American type
culture collection (ATCC) e isolados de amostras clínicas, sendo:
- Bactérias Gram positivas: Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Listeria
monocytogenes (isolado clínico);
- Bactérias Gram negativas: Escherichia coli ATCC 25922, Providencia rettgeri ATCC 29944;
- Fungo leveduriforme: Candida albicans ATCC 14408.
A metodologia aplicada para realização destes testes está disponível nos anexos.
84 6.2.1 Resultados
Para a avaliação da atividade biológica dos nossos compostos frente aos microrganismos testados, não foi utilizado nenhum fármaco de referência para efeito de comparação das atividades antimicrobiana e antifúngica, e os resultados das atividades foram avaliados em termos da CIM (concentração inibitória mínima) de cada composto ensaiado. A CIM expressa a sensibilidade dos microrganismos aos antimicrobianos (ou compostos candidatos a antimicrobianos) e corresponde à menor concentração do composto capaz de inibir o desenvolvimento visível do microrganismo. Os resultados obtidos estão dispostos na Tabela 12.
Tabela 12– Resultados da atividade antimicrobiana de alguns isoxazóis 3,5-dissubstiuídos Comp P.rettgeri (μM) E.coli (μM) L.monocytogenes (μM) S.aureus (μM) C.albicans (μM) 44a 251 >251 <1,96 125,50 >251 44b - >267 >267 >267 >267 44c 29,63 59,25 118,5 <237 29,63 44e 7,02 225 112,50 <225 >225 44f 81,75 40,88 <2,55 <327 40,88 44g 227 >227 <1,77 <1,77 <1,77 44h >282 >282 >282 >282 70,50 44j >305 >305 >305 >305 9,52 45a >170,5 85,25 42,63 341 <2,66 45b >357 >357 44,63 >357 357 45e 10,20 81,75 <2,55 <327 >327 45h 372 93 186 >372 23,25 45n >361 >361 >361 >361 45,13 45o >391 >391 >391 >391 97,75 45p >379 >379 >379 >379 5,91 46f 341 >341 <2,66 >341 >341
De acordo com os resultados apresentados na Tabela 12, as melhores respostas da atividade dos compostos testados foram exibidas para as bactérias gram positivas. Para a Staphylococcus aureus o composto que apresentou menor CIM 4g (<1,77 μM) tem na sua estrutura molecular o anel furano e, provavelmente, o
85
efeito inibitório observado possa ser atribuído a ele, no entanto, isto é, uma asserção apenas inicial e estudos adicionais deverão ser realizados para uma avaliação mais completa dessa observação. Para a Listeria monocytogenes os resultados mostraram que grupos doadores no aromático apresentam maior potencial de inibição do crescimento da mesma, mas, uma correlação com a estrutura ainda não pode ser feita, sendo elas 44g (<1,77 μM); 44a (1,96 μM); 44f (<2,55 μM); 45e (<2,55 μM) e 46f (<2,66 μM). Para as bactérias gram negativas menos moléculas foram ativas. Para a Escherichia coli o composto 44f (40,88μM) foi o mais ativo, e para a Providencia rettgeri 44e (7,02μM) e 5e (10,25μM) foram mais ativos. No composto 44f estão pesentes três grupos metoxilas, enquanto que, nos compostos
44e e 45e encontra-se flúor como um aril-substituinte (no isoxazol e em seu
corresponde derivado alquilado). Em ambos casos, são grupos doadores de densidade eletrônica (por ressonância) e os efeitos inibitórios observados para os compostos onde estão presentes podem estar correlacionados entre si, no entanto, estudos adicionais sobre o mecanismo de ação para bioatividades observadas devem ser realizados para melhor entendimento desta questão.
Os compostos que apresentaram melhores atividades contra o fungo C.
albicans foram 44g (<1,77 µM), 45a (<2,66 µM), 45p (5,91μM) e 44f (9,52μM), sendo
que o composto 44g foi o mais ativo, podendo ser atribuído ao furano o efeito de inibição da proliferação desse fungo. Os outros compostos considerados ativos possuem em suas estruturas como arilsubstituintes grupos doadores, sendo um indício de que grupos doadores aumentam o potencial antimicrobiano desses compostos. Porém, ainda não pode ser feita uma relação entre estrutura e atividades, contudo, mais estudos devem ser feitos neste sentido.
Em relação aos grupos alquilados e não alquilados, não pode se afirmar qual deles apresenta maior potencial, pois ambas apresentaram atividade para os microrganismos.
86 7 CONCLUSÕES
Técnicas foram utilizadas para impedir ou minimizar a formação isomérica, porém, sem sucesso. A alquilação dos isoxazóis de fato facilitou bastante a purificação, pois, as moléculas tornaram-se menos polares.
Os isoxazóis e seus derivados são potencias antimicrobianos, por esse motivo, os isoxazóis 3,5-dissubstituídos e seus derivados foram testados quanto essa propriedade biológica. Os resultados foram bastante promissores, pois um número considerável de substâncias inibiram o crescimento das bactérias e fungo em concentrações baixas. Das 20 moléculas testadas 12 são inéditas, sendo de grande relevância o empenho de esforços sintéticos no estudo desses compostos.
Os testes para doença de Chagas também são promissores, pois, apesar das moléculas não terem apresentado seletividade desejável, elas foram ativas, sendo necessário um estudo mais aprofundado para correlacionar o efeito tripanocida com as estruturas das moléculas.
Por se tratar de um estudo pioneiro na aplicação dessas moléculas contra T.
cruzi os resultados obtidos foram muito relevantes, servindo de base para futuras
pesquisas envolvendo os isoxazóis 3,5-dissubstituídos e seus derivados.
Como as moléculas apresentaram capacidade para matar o parasito, porém, com baixa seletividade, caminhos para melhorar esse aspecto serão adicionalmente investigados como, por exemplo, a modificação estrutural desses compostos com a adição de grupos como Br, Cl e NO2 que apresentam potencial para eliminar o
parasito. Esses compostos isoxazolínicos são susceptíveis a reações de substituição no C-4 no anel heterocíclico de cinco membros. Contudo, isso é influenciado pelos substituintes nas posições C-3 e C-5, do mesmo heterocíclico.
Tendo em vista que já existem relatos dessas reações que introduzem esses tipos de grupos no C-4 do heterocíclico de cinco membros, a intenção de nosso grupo de pesquisa é avaliar no futuro os efeitos de tais substituintes no ciclo de vida do Tripanossoma cruzi.
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92 ANEXO I
Metodologias utilizadas para a realização dos testes biológicos
Atividades antimicrobianas
Ensaio antimicrobiano
A atividade antimicrobiana quantitativa foi determinada a partir do método de microdiluição seriada 1:2 para determinação da concentração inibitória mínima (CIM), ou seja, a última concentração dos compostos testados em que não houve crescimento bacteriano (Ostrosky et al., 2008).
Este método de microdiluição em microplacas de 96 poços gera uma relação geométrica decrescente de concentração. Desta forma à medida que a concentração dos compostos testados diminui, foi observado o momento em que houve o crescimento microbiano, sendo determinada a concentração inibitória mínima, ou seja, a última concentração onde não há crescimento do micro- organismo.
Para o preparo do inóculo, as bactérias foram repicadas em placas de Petri contendo Ágar Mueller Hinton (Predimol®) e a levedura foi repicada em Ágar