Speil-effekten

Após 23 dias do implante tumoral, os animais foram sacrificados e os tumores, assim como os pulmões, baço, fígado e rins foram dissecados para análises histopatológicas. Nestas análises, pode-se observar que os tumores dos animais pertencentes ao grupo Cont estavam bem desenvolvidos, com polimorfismo celular evidente, com invasão do tecido adiposo adjacente e o tecido muscular (Figura 39A e 39G). Ainda no controle, foram evidentes regiões centrais de necrose ocasionadas possivelmente por hipóxia e muitos infiltrados inflamatórios, sendo estes característicos de tumores com metástase (Figura 39D). Nos tumores tratados com Mel a diminuição de células neoplásicas foi evidente, com a eliminação dessas células da extremidade do tumor para a região central, e o aparecimento do tecido adiposo e muscular (Figura 39B e 39H) e, ainda, a presença de bastante infiltrado inflamatório e pouca necrose (Figura 39E). No tratamento com as nanopartículas Completa também houve diminuição de células neoplásicas com processo similar ao tratamento com Mel, com reaparecimento do tecido adiposo, muscular e presença de infiltrado inflamatório (Figura 39C, 39F e 39I). Porém o tratamento com Completa foi menos ativo, ou até mais lento, em promover a diminuição de células neoplásicas quando comparado ao grupo Mel.

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Controle Melitina Completa

Figura 39: Fotomicrografias de tumores desenvolvidos após 23 dias do implante de células de mama 4T1 em camundongos Balb/c. Polimorfismo celular na primeira linha. Seta preta indica necrose na segunda linha. Retângulo indica diminuição de células neoplásicas em E e F. Na terceira linha células invadindo tecido muscular em G, e diminuição de células neoplásicas em H e I. A, D, G) Sem tratamento (Cont). B, E, H) Tratado com o peptídeo melitina extraído da peçonha de Apis mellifera (Mel). C, F, I) Tratado com partícula (Completa – QS, TPP, Pepdirecionador2, melitina, PEG). Tratamentos com 2 mg/mL de melitina. Coloração H&E.

Apesar das análises macroscópicas terem revelado metástase para o peritônio e as análises microscópicas dos tumores também terem indicado metástase para os tecidos adjacentes ao parênquima da mama, não foi observada metástase das células tumorais da mama para os pulmões, fígado, rins ou baço.

Os pulmões dos animais de todos os grupos apresentaram as bordas do órgão, assim como os alvéolos com estruturas regulares (Figura 40A). Porém, havia muitas

B C

A

D E F

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células sanguíneas, caracterizando hemólise, nos tratados com melitina e, também, havia linfócitos, caracterizando processo inflamatório (Figura 40B). Já nos animais tratados com a formulação Completa houve apenas a presença do infiltrado inflamatório (Figura 40C).

Já nos fígados dos animais de todos os grupos foi observaado algumas alterações que indicam danos no órgão. No grupo controle foram observadas regiões de deterioração nuclear em alguns hepatócitos e também, a presença de pigmentos escuros, provável aglomerados de ferritina (Figura 40D). No grupo melitina foram observadas as mesmas alterações presentes no grupo Cont, e mais, também, processos de vacuolização (Figura 40E). No grupo tratado com formulação Completa foram observadas alterações em toda área analisada com hipertrofização, núcleos picnóticos e vacuolização nos hepatócitos (Figura 40F).

Nos rins observou-se em todos os grupos a presença de glomérulos maiores do que o padrão de camundongos, com muitas células, em particular com muito linfócitos (Figura 40G e 40I). No grupo tratado com Mel, ainda pode-se observar presença de regiões características de hemólise (Figura 40H).

O baço de animais de todos os grupos apresentou a polpa branca e vermelha sem alterações (Figura 40J, 40K e 40L).

Assim, foram observados danos no fígado e glomérulos maiores nos rins em animais de todos os grupos e, ainda o tratamento com Mel causou hemólise evidente no pulmão, rins e baço, enquanto a formulação Completa não causou o mesmo efeito histopatológico.

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Controle Melitina Completa Pulmão

Fígado

Rim

Baço

Figura 40: Fotomicrografias de pulmão, fígado, rim e baço após 23 dias do implante de células de mama 4T1 em camundongos Balb/c. A, D, G, J) Sem tratamento (Cont). B, E, H, K) Tratado com o peptídeo melitina extraído da peçonha de Apis mellifera (Mel). C, F, I, L) Tratado com partícula (Completa – QS, TPP, Pepdirecionador2, melitina, PEG). Seta grossa indica um infiltrado inflamatório; quadrado indica área de deterioração nuclear; seta fina indica vacuolização; circulo indica hemorragia; Coloração H&E.

A B C

D E _F

J K L

106

5.5.2.5 Análises hematológicas e bioquímicas

Os dados hematológicos e bioquímicos obtidos nesse trabalho foram comparados aos dados citados na literatura por MIYASHIRO et al. (2010) e aos obtidos para o grupo sadio (controle negativo) por CARNEIRO (2011), sendo ambos utilizados como referência. Os animais sadios, os quais não tinham tumor e receberam tratamento com água, eram da mesma raça, estavam em condições ambientais e de manutenção idênticos aos tratados neste trabalho assim como com peso e idade (12 semanas) semelhantes.

Os resultados dos exames hematológicos dos grupos que receberam implante tumoral foram similares aos resultados das referências, com exceção do número de plaquetas que foi aproximadamente 45% menor nos grupos Cont e Mel, e 27% menor no grupo Completa em relação às referências, porém não houve diferença significativa entre os grupos (considerando P < 0,05), (Tabela 7).

Tabela 7: Dados hematológicos de camundongos Balb/c fêmea com carcinoma

mamário (Média ± SEM).

Cont Mel Completa Sadio Referência

Hemácias (106/mm³) 8,3 ± 0,5 8,1 ± 0,0 8,1 11,6 ± 2,2 7,3-10,5 Hemoglobina (g/dL) 13,3 ± 0,7 12,8 ± 0,0 12,8 15,4 ± 0,4 12,0-15,0 Hematócrito (%) 41,4 ± 1,7 40,0 ± 0,1 39,4 46,0 ± 1,5 35,0-50,0 Plaquetas (10³/mm³) 277,0 ± 24,4 256,5 ± 84,2 331,0 454,6 ± 64,7 497,0

Animais tratados com água (Cont), melitina (Mel) e formulação Completa (QS, melitina,TPP, PEG e Pepdirecionador2) por via intratumoral (2 mg/kg). Os valores do grupo sadio e referência foram obtidos na literatura. Os valores diferentes das referências estão destacados em negrito.

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Os resultados para bastonetes, eosinófilos e basófilos de todos os grupos foram semelhantes às referências. Porém houve uma redução de aproximadamente 50% do número de leucócitos no grupo Mel em relação à referência, enquanto os outros grupos estavam com valores semelhantes à referência. Já os linfócitos foram diminuídos em 98%, aproximadamente, nos grupos Cont e Completa e 76% no grupo Mel. O contrário foi observado para o percentual de segmentados (neutrófilos), o qual foi aumentado em 6×, aproximadamente, em todos os grupos em relação à referência. Os monócitos apresentaram um aumento de 50%, aproximadamente, nos grupos Cont e Mel em relação ao grupo sadio; e o grupo Completa aumentou 6,5× em relação ao grupo sadio. Porém nenhum alteração foi considerada significativamente diferença (considerando P < 0,05), (Tabela 8).

Tabela 8: Resultados da contagem total e número relativo (%) de leucócitos em camundongos Balb/c fêmea com carcinoma mamário (Média ± SEM).

Cont Mel Completa Sadio Referência

Leucócitos ×10³ (/mm³) 12,8 ± 29,0 6,2 ± 1,6 13,4 10,3 ± 0,3 12,0-13,0 Linfócitos (%) 1,0 ± 0,0 16,2 ± 14,9 1,0 79,3 ± 9,1 65,9-77,9 Bastonetes (%) 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 1,0 ± 1,0 0,1-0,8 Segmentados (%) 94,0 ± 1,1 80,7 ± 14,2 86 17,3 ± 6,8 15,7-18,5 Eosinófilos (%) 0,33 ± 0,33 0,0 ± 0,0 0,0 0,3 ± 0,3 2,0-2,7 Basófilos (%) 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 ± 0,0 - Monócitos (%) 4,6 ± 1,2 3,0 ± 0,8 13,0 2,0 ± 1,0 1,0-1,1

Animais tratados com água (Cont), melitina (Mel) e formulação Completa (QS, TPP, Pepdirecionador2, melitina, PEG) por via intratumoral (2 mg/kg). Os valores do grupo sadio e referência foram obtidos na literatura. Os valores diferentes das referências estão destacados em negrito.

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Por meio de análises do soro sanguíneo, podem-se verificar possíveis alterações no fígado e rins dos animais por meio de análises bioquímicas de ALT e creatinina, respectivamente. Os grupos Cont, Mel e Completa apresentaram valores de creatinina 50% abaixo dos valores das referências. Já na análise de ALT o grupo Mel apresentou valor 20% mais elevado do que as referências e o grupo Completa quase 50% maior do que as referências. Estas alterações não foram significativamente diferentes (considerando P < 0,05) (Tabela 9).

Tabela 9: Análise bioquímica obtida a partir do soro sanguíneo em camundongos Balb/c fêmea com carcinoma mamário (Média ± SEM).

Controle Melitina Completa Sadio Referência

Creatinina (mg/dL)

0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,07 0,13 0,13

ALT (U/L) 31,0 ± 8,1 43,5 ± 16,7 65,0 35,0 35,0

Animais tratados com água (Cont), melitina (Mel) e formulação Completa (QS, melitina, TPP, Pepdirecionador2 e PEG) por via intratumoral (2 mg/kg). Os valores do grupo sadio e referência foram obtidos na literatura. Os valores diferentes das referências estão destacados em negrito.