Foram utilizadas as linhagens tumorais de mama 4T1 e MCF-7 murina e humana, respectivamente, ambas de origem epitelial. Como controle foi utilizada a linhagem não tumoral murina de fibroblasto (NIH3T3), de origem conjuntiva. Todas as linhagens foram mantidas no Laboratório de Morfologia e Morfogênese, Instituto de Biologia, Universidade de Brasília.
As células foram descongeladas e transferidas para frascos contendo 3 mL de meio de cultura (DMEM completo, tamponado com bicarbonato de sódio, acrescido de 10% de soro fetal bovino e 1% do antibiótico ampicilina - estreptomicina) em tubos tipo Falcon de 15 mL. Os tubos foram centrifugados a 750 g por três minutos, o sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido em 1 mL de meio de cultura. Este foi transferido para um frasco pequeno de cultura de células, que continha 5 mL de meio, e incubados em estufa a 37°C e 5% de CO2 durante 24 horas.
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Após 24 horas do descongelamento, o meio de cultura do frasco contendo as células foi descartado e mais 5 mL de meio foram adicionados ao frasco para fornecer nutrientes e permitir o crescimento das células. As células foram observadas em microscópio de luz invertido antes de cada troca de meio de cultura e após o tratamento, visando a observar os aspectos morfológicos, crescimento celular e a possível presença de contaminantes.
Para evitar confluência alta (densidade de células elevada) nos frascos, a cada 72 horas o meio de cultura era descartado e 3 mL da solução de tripsina-EDTA (Tripsina, 0,25% (1×) com EDTA tetrassódico) era adicionada ao frasco para remover a camada de células, que estavam aderidas ao fundo da placa. O frasco foi levado para estufa a 37°C e 5% de CO2 por 3 minutos, e em seguida, leves batidas foram dadas no frasco
para desprender as células, que foram analisadas ao microscópio de luz invertido para confirmar a remoção. Para neutralizar a ação da tripsina sobre as células foram adicionados 3 mL de meio de cultura, uma vez que esta se liga à albumina presente no meio. O conteúdo do frasco foi transferido para um tubo plástico de 15 mL e centrifugado a 750 g por 3 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido em 1 mL de meio de cultura, do qual 200 µL foram transferidos para o frasco, que continha 5 mL de meio de cultura novo. O frasco contendo as células foi incubado em estufa a 37°C e 5% de CO2.
O restante da suspensão de células foi utilizado para o congelamento e armazenamento. Assim, as células foram centrifugadas a 750 g por 3 minutos, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspendido em meio de congelamento (DMEM, soro fetal, antibiótico, de dimetilsulfóxido - DMSO, 78:20:1:1, v:v:v:v). A suspensão celular foi transferida para criotubos, os quais foram mantidos a -80°C por 24 horas e, em seguida, estocados imersos em nitrogênio líquido.
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4.9.2 Tratamento das células
As células foram retiradas da estufa, tripsinizadas e ressuspendidas em 1 mL de meio de cultura. Um volume de 10 µL desta suspensão foi misturado a 50-60 µL, da solução de azul de tripan (0,4%, p/v, em PBS: 50 mmol/L fosfato de potássio; 150 mmol/L NaCl; pH 7,2) para determinar o número de células. Foram depositados 10 µL desta mistura em uma câmara de Neubauer, onde as células presentes nos quatro quadrantes maiores laterais foram contadas utilizando microscópio de luz invertido. O número de células foi determinado pela fórmula:
Número de células/mL = Número de células contadas × fator de diluição × 104 Número de quadrantes contados
A quantidade de células obtidas no cálculo foi dividida pelo número de células padronizado para todas as linhagens (8 × 103). Desta forma obteve-se a quantidade de células em volume, as quais eram acrescidas de meio de cultura. Da mistura do meio de cultura contendo células, foram transferidos 200 µL para cada poço da placa de 96 poços, que foi incubada em estufa a 37°C e 5% de CO2.
Após 24 horas de plaqueamento, as células foram observadas no microscópio de luz invertido para verificar a morfologia e a distribuição das mesmas na placa. Em seguida, o meio de cultura foi substituído por outro meio de cultura contendo o tratamento. Soluções dos tipos de partículas descritas no item 4.6 e concentrações seriadas da melitina e do peptídeo direcionador (0, 4, 8, 16, 32, 64 µg/mL) dissolvidas no meio de cultura foram adicionadas às células. O controle foi composto por meio de cultura e água Milli-Q no mesmo volume da maior concentração dos tratamentos. A placa foi incubada em estufa a 37°C e 5% de CO2 por 24 horas.
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4.9.3 Efeito citotóxico in vitro avaliado pelo método MTT
Para verificar a atividade das partículas, da melitina e do peptídeo direcionador sobre as linhagens celulares foi utilizado o método colorimétrico MTT (MOSMANN, 1983). Neste teste, as enzimas mitocondriais, como a succinato desidrogenase, catalisam a redução do substrato MTT (brometo de [3(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolium) por meio do FADH2 produzindo formazan, que é um produto de
coloração azulada. Desta forma a viabilidade celular está diretamente relacionada à quantificação da produção de formazan pelas células.
Assim, após 24 horas do tratamento, o meio de cultura foi retirado dos poços e adicionados 150 µL de solução de MTT a cada poço (15 µL de MTT a uma concentração de 5 mg/mL diluído em 135 µL de meio DMEM completo). Em seguida, a placa permaneceu incubada em estufa durante 3 horas e, após este tempo, a solução de MTT foi substituída por DMSO. Apenas 100 µL de DMSO foram colocados em cada poço das placas e levemente resuspendido, visando à solubilização do formazan formado.
A quantificação do formazan foi realizada por meio de leitura em espectrofotômetro conjugado a uma leitora de microplacas (BioRad 3550-UV), no qual mediu-se a absorbância da solução presente nos poços no comprimento de onda de 595 nm.
Finalmente, foi obtida a média das triplicatas experimentais para determinar a viabilidade celular em porcentagem. Para isso foi utilizada a seguinte equação, na qual A é absorbância, B é o branco e C é o controle:
Viabilidade celular % = (A – B) × 100 C
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