4. Sakhalin II: Putin goes green?
4.8 The shell closes
4.2.1 Atividade Antimicrobiana
As atividades dos complexos de gálio contra as bactérias Staphylococcus aureus e
80 seguindo o procedimento descrito na parte experimental.27 As concentrações inibitórias mínimas (CIM) foram determinadas para os complexos e seus ligantes com o intuito de avaliar quantitativamente os efeitos da complexação sobre a atividade in vitro.
Os compostos estudados não apresentaram atividade frente à bactéria gram-negativa P.
aeruginosa. Os valores de CIM dos compostos contra S. aureus e C. albicans são apresentados
na Tabela 4.11.
Tabela 4.11. Concentração inibitória mínima (CIM) das hidrazonas derivadas de 2-acetilpiridina e 2-benzoilpiridina, seus complexos de gálio(III), cloridrato de tetraciclina e fluconazol contra S. aureus
(ATCC6538) e C. albicans (ATCC18804)
Composto CIM / µmol L
-1 S. aureus CIM / µmol L-1 C. albicans H2AcPh 428 213 [Ga(2AcPh)2]NO3·H2O (1) 159 77 H2AcpC Ph 197 46 [Ga(2AcpC Ph)2]NO3·H2O (2) 73 9 H2AcpNO2Ph 353 > 179 [Ga(2AcpNO2Ph)2]NO3·1,5H2O (3) 146 34 H2BzPh 169 > 68 [Ga(2BzPh)2]NO3·2H2O (4) 68 131 H2BzpC Ph > 158 > 31 [Ga(2BzpC Ph)2]NO3·2H2O (5) 68 32 H2BzpNO2Ph > 75 > 18 [Ga(2BzpNO2Ph)2]NO3·H2O (6) > 63 > 12 Cloridrato de tetraciclina 0,3 ---- Fluconazol ---- 33
As hidrazonas derivadas de 2-acetilpiridina já tiveram suas atividades frente a S. aureus e C. albicans descritas por outros membros do nosso grupo.10 Conforme relatado, as atividades
antimicrobianas seguem a ordem H2AcPh < H2AcpNO2Ph < H2AcpC Ph, sugerindo que o
efeito retirador de elétrons dos grupos nitro e cloro pode favorecer a atividade contra esses microorganismos. A baixa solubilidade das hidrazonas derivadas de 2-benzoilpiridina impossibilitou a obtenção das CIMs, impedindo a determinação da ordem de atividade antimicrobiana desses compostos.
27 National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests
for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard—Sixth Edition. NCCLS document M7-A6 (ISBN 1- 56238-486-4). NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2003.
81 Os valores de CIM obtidos contra S. aureus sugerem que as hidrazonas estudadas e seus respectivos complexos de gálio(III) não apresentam atividade significativa. No entanto, é possível verificar uma pequena redução no valor da CIM após a complexação ao metal. As maiores atividades são verificadas para os complexos (4) e (5), os quais apresentam as hidrazonas derivadas de 2-benzoilpiridina em suas estruturas.
Os resultados dos testes contra C. albicans mostram que a complexação reduz significativamente os valores de CIM obtidos para as hidrazonas derivadas de 2-acetilpiridina, sendo que o melhor resultado é observado para 2. No caso da hidrazona H2AcpC Ph, o valor da CIM é similar ao do fármaco fluconazol. Após a coordenação, a atividade apresentada por 2 (CIM = 9 µmol L-1) é superior àquela verificada pelo composto de referência (CIM = 33 µmol L-1). Os valores de CIM obtidos para os complexos (1) e (3) são comparáveis ao de fluconazol.
A baixa solubilidade das hidrazonas derivadas de 2-benzoilpiridina e seus complexos de gálio(III) impossibilitou a determinação das CIMs desses compostos. Desta forma, uma comparação das atividades antifúngicas dos complexos com as dos seus respectivos ligantes não foi possível.
4.2.2 Atividade Citotóxica
Os efeitos citotóxicos das hidrazonas e seus complexos de gálio(III) foram investigados contra duas diferentes células de glioblastoma. Estudos prévios do genótipo da proteína p53 e da sensibilidade de linhagens de células cancerígenas humanas a fármacos antitumorais revelaram que células em que a proteína p53 está ausente ou que apresentam a proteína mutante são menos sensíveis à maioria dos compostos em uso clínico que as células que expressam essa proteína.28 Por isso, as células escolhidas para a avaliação da atividade antitumoral dos compostos foram células U87, que expressam a proteína p53, e células T98, que expressam a proteína mutante.
Um estudo preliminar do efeito citotóxico das hidrazonas e seus complexos de gálio(III) foi realizado, onde a concentração dos compostos foi 1,0 µmol L-1. Os resultados são apresentados na Figura 4.8 como porcentagem de sobrevivência celular.
A porcentagem de sobrevivência das células U87 e T98 na presença das hidrazonas derivadas de 2-acetilpiridina encontra-se entre 14,4 e 35,1 %. Por sua vez, a sobrevivência celular na presença das hidrazonas derivadas de 2-benzoilpiridina foi superior a 54,8 %.
82 Todos os complexos de gálio(III) apresentaram atividade citotóxica frente as células U87 superior à atividade exercida pelas hidrazonas livres, com sobrevivência celular entre 4,4 e 30,4 %. Os resultados obtidos para as células T98 revelam que o efeito citotóxico das hidrazonas derivadas de 2-acetilpiridina e seus complexos de gálio(III) são comparáveis, indicando que a coordenação não melhorou a atividade. Por outro lado, a coordenação ao gálio(III) aumentou a atividade citotóxica das hidrazonas derivadas de 2-benzoilpiridina contra essas células.
Figura 4.8. Efeito citotóxico das hidrazonas derivadas de 2-acetilpiridina e 2-benzoilpiridina e seus complexos de gálio(III) contra as células de glioblastoma U87 e T98. As células foram tratadas com 1,0 µmol L-1 por um
período de 48 horas e a sobrevivência celular foi medida pelo método MTT.
Esses estudos estimularam a determinação da concentração dos compostos capaz de matar 50 % das células estudadas (IC50). No entanto, valores de IC50 dos complexos de gálio(III)
não foram determinados devido à sua baixa solubilidade. Além disso, os valores de IC50 das
hidrazonas contra células de fibroblastos humano MRC5, as quais atuam como um modelo de células saudáveis, também foram determinados. Etoposídeo, fármaco antineoplásico em uso clínico, foi utilizado como controle positivo. Os valores de IC50 das hidrazonas frente às células
U87, T98 e MRC5 são apresentados na Tabela 4.12.
Todas as hidrazonas, exceto H2BzpNO2Ph, são altamente ativas contra as células de
glioblastoma estudadas, com valores de IC50 entre 0,07 e 26,1 nmol L-1 contra células U87 e
entre 0,43 e 415 nmol L-1 contra células T98. Esses valores de IC
50 são inferiores ao valor
observado para o etoposídeo, indicando que as hidrazonas foram mais ativas que o composto de referência.
As hidrazonas derivadas de 2-acetilpiridina foram mais ativas que as correspondentes derivadas de 2-benzoilpiridina frente todas as linhagens celulares. H2AcpC Ph foi a hidrazona
83 mais citotóxica frente às células U87, enquanto H2AcpNO2Ph foi o composto mais ativo contra
as células T98.
Os valores de IC50 das hidrazonas frente a células MRC5 foram muito maiores que
aqueles verificados frente às células de glioblastoma. De fato, os índices terapêuticos (IT = IC50MRC5/IC50glioma) da maioria das hidrazonas foram muito altos. Uma vez que o índice
terapêutico é utilizado como um padrão de segurança de um fármaco, as hidrazonas utilizadas podem ser consideradas bons candidatos a protótipos de fármacos para o tratamento de tumores cerebrais.
Tabela 4.12. Valores de IC50 (nmol L-1) para as hidrazonas derivadas de 2-acetilpiridina e 2-benzoilpiridina e
etoposídeo frente a células de glioblastoma U87 e T98 e frente a células de fibroblastos humano MRC5
Composto
Linhagem celular de glioblastoma
Células de fibroblastos de pulmão de feto humano
Índice de Terapêutico (IT)* U87 T98 MRC5 U87 T98 H2AcPh 0,94 ± 0,01 0,80 ± 0,07 284 ± 15 302 355 H2AcpC Ph 0,07 ± 0,01 1,17 ± 0,3 348 ± 37 4971 297 H2AcpNO2Ph 0,57 ± 0,07 0,43 ± 0,04 283 ± 33 496 658 H2BzPh 8,26 ± 1 7,41 ± 0,4 1180 ± 127 143 159 H2BzpC Ph 26,1 ± 15 415 ± 31 738 ± 13 28 1,8 H2BzpNO2Ph > 500 > 500 551 ± 53 --- --- Etoposídeo 620 ± 15 460 ± 25 --- --- ---
*IT = IC50MRC5/IC50glioma
Modificações fenotípicas significativas foram observadas em ambas as linhagens celulares de glioblastoma, mas não nas células MRC5, após exposição aos compostos testados. Conforme mostrado na Figura 4.9, as células do grupo controle apresentam expansões citoplasmáticas, enquanto o tratamento com as hidrazonas causou retração dessas expansões, levando ao arredondamento das células, o encolhimento celular e formação de bolhas das células de U87 e T98. Essas mudanças morfológicas apresentam uma tendência dose-resposta e são associadas com morte celular por apoptose. Uma redução do número de células após o tratamento também foi observado.
84
Figura 4.9. Células de glioblastoma U87 e T98 e células de fibroblastos humano MRC5 tratadas com as hidrazonas derivadas de 2-acetilpiridina e 2-benzoilpiridina. Amplificação: 400 X.
A morte por via apoptótica induz fragmentação do DNA através da ativação de endonucleases específicas do DNA. A ativação de nucleases pode ser identificada através do uso de DNA corado com 4’,6-diamidina-2-fenilindol (DAPI), o qual detecta o DNA fragmentado e a condensação da cromatina.
Nenhuma fragmentação do DNA foi observada nas células do grupo controle (não tratadas com as hidrazonas) e nas células MRC5. No entanto, após exposição às hidrazonas, as células de glioblastoma mostraram fragmentação do DNA, conforme verificado na Figura 4.10
85 para H2AcpC Ph frente a células U87. Esses resultados sugerem que a redução da sobrevivência celular após o tratamento ocorre, pelo menos em parte, devido à indução de apoptoses.
Figura 4.10. Células de glioblastoma U87 e células de fibroblastos humano MRC5 tratadas com H2AcpC Ph e coradas com DAPI. Amplificação: 400 X.
Com o intuito de avaliar as propriedades estéreo-eletrônicas que podem estar envolvidas no mecanismo de ação das hidrazonas, um estudo da relação estrutura-atividade (SAR) dos compostos foi realizado. As propriedades de interesse neste estudo foram as energias de HOMO e LUMO, o momento dipolo, a área de superfície e o logP das hidrazonas, as quais foram correlacionadas com os valores de IC50. Essas propriedades foram calculadas segundo a
metodologia descrita na seção 2.4.1 e seus valores são apresentados na Tabela 4.13.
Para a obtenção de matrizes de correlação, a existência dos isômeros E e Z das hidrazonas foi considerada. Analisando-se separadamente os isômeros E e Z, verifica-se a presença de uma correlação inversa entre o logP e a atividade das hidrazonas frente a ambas as linhagens celulares (R = -0,73 para U87 e R = -0,93 para T98). Correlação inversa também foi verificada entre a área de superfície e a atividade frente às células testadas (R = -0,83 frente às células U87 e R = -0,82 frente as células T98). Então, menores de valores de logP e área de superfície contribuem para um maior efeito citotóxico. De fato, as hidrazonas derivadas de 2- acetilpiridina, as quais apresentam menores valores de logP e menores áreas superficiais, são mais ativas que as correspondentes derivadas de 2-benzoilpiridina.
Considerando-se os isômeros majoritários (isômero E para H2AcPh, H2AcpC Ph e H2AcpNO2Ph e isômero Z para H2BzPh, H2BzpC Ph e H2BzpNO2Ph), as correlações inversas
86 investigadas. Além disso, a análise dos isômeros majoritários revelou uma nova correlação inversa entre o momento dipolo e a atividade das hidrazonas (R = -0,84 para U87 e T98).
Tabela 4.13. Propriedades estéreo-eletrônicas calculadas para as hidrazonas derivadas de 2-acetilpiridina e 2-benzoilpiridina Composto (HOMO) (eV)* (LUMO) (eV) Momento dipolo (db) LogP Área de superfície (A2) H2AcPh -8,560 (isômero E) -8,545 (isômero Z) 1,978 (isômero E) 1,780 (isômero Z) 3,365 (isômero E) 5,308 (isômero Z) 1,92 342,28 H2AcpC Ph -8,692 (isômero E) -8,689 (isômero Z) 1,813 (isômero E) 1,632 (isômero Z) 3,381 (isômero E) 6,672 (isômero Z) 2,53 359,09 H2AcpNO2Ph -8,898 (isômero E) -8,933 (isômero Z) 0,803 (isômero E) 0,998 (isômero Z) 4,717 (isômero E) 8,855 (isômero Z) 2,15 383,15 H2BzPh -6,801 (isômero E) -6,620 (isômero Z) 1,558 (isômero E) 1,344 (isômero Z) 3,104 (isômero E) 4,976 (isômero Z) 3,10 419,37 H2BzpC Ph -8,639 (isômero E) -8,346 (isômero Z) 1,814 (isômero E) 1,527 (isômero Z) 3,440 (isômero E) 6,386 (isômero Z) 3,68 436,41 H2BzpNO2Ph -8,832 (isômero E) -8,549 (isômero Z) 0,833 (isômero E) 0,955 (isômero Z) 5,072 (isômero E) 8,585 (isômero Z) 3,31 459,15 * eV = 627.51 Kcal mol-1 4.2.3 Atividade Antimalárica
Uma avaliação da atividade contra malária foi realizada para as hidrazonas derivadas de 2-acetilpiridina e seus complexos de gálio(III). A escolha por esta classe de hidrazonas deveu-se à sua maior solubilidade quando em comparação com suas correspondentes derivadas de 2-benzoilpiridina.
A atividade antimalárica dos compostos foi avaliada através de culturas de eritrócitos parasitados com Plasmodium falciparum. Os resultados obtidos são expressos como concentração do composto capaz de inibir 50 % do crescimento dos parasitas (IC50). A dose
mínima capaz de matar 50 % das células de hepatoma humano HepG2 (LD50) também foi
determinada. Cloroquina, um antimalárico em uso clínico, foi utilizado como controle positivo. Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 4.14.
87
Tabela 4.14. Valores experimentais de IC50 frente Plasmodium falciparum e de LD50 frente a células de
hepatoma humano para as hidrazonas derivadas de 2-acetilpiridina
Composto IC50 (µmol L-1) LD50 (µmol L-1) Índice Terapêutico (IT)*
H2AcPh 0,690 ± 0,560 1145 ± 50 1659 1 0,399 ± 0,250 246 ± 40 616 H2AcpC Ph 0,731 ± 0,440 413 ± 26 565 2 0,367 ± 0,036 19 ± 1 52 H2AcpNO2Ph 0,616 ± 0,440 3272 ± 246 5312 3 0,290 ± 0,026 6,0 ± 0,4 21 Ga(NO3)3 > 100 > 100 --- Cloroquina 0,188 ± 0,006 797 ± 16 4239 *IT = LD50/IC50
As hidrazonas derivadas de 2-acetilpiridina e seus complexos de gálio(III) foram ativos contra P. falciparum, apresentando valores de IC50 entre 0,290 e 0,690 µmol L-1. Comparando-se
a atividade das hidrazonas livres com a dos seus respectivos complexos, verifica-se que a coordenação provoca uma pequena redução nos valores de IC50 dos compostos. No entanto, esta
diferença não é considerada significativa, uma vez que cada mol de complexo apresenta dois mols da hidrazona. Além disso, os complexos de gálio(III) apresentam valores de LD50 entre 6,0
e 246 µmol L-1, os quais são inferiores aos valores obtidos para as hidrazonas (413 a 3272 µmol L-1), indicando que as hidrazonas são menos tóxicas que seus complexos.
A baixa toxicidade das hidrazonas é confirmada pelos elevados valores de índice terapêutico dos compostos, sugerindo que esses compostos inibem o crescimento do parasita sem provocar morte celular. Desta forma, o melhor resultado foi verificado para a hidrazona H2Ac4oNO2Ph, a qual apresentou IT superior ao verificado para a cloroquina.
Os resultados obtidos indicam que a coordenação das hidrazonas ao gálio(III) não foi uma boa estratégia para redução de doses. Por outro lado, as hidrazonas testadas foram altamente ativas e seletivas, sugerindo que são potenciais agentes antimaláricos.
88
Capítulo 5. Complexos de gálio(III) e bismuto(III) de 2-hidroxi-3-(3-metil-2-butenil)-1,4-