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4.1 - Introdução
Diabrotica é um gênero de besouro da família Chrysomelidae, que comporta diversas pragas agronômicas na Europa e nas Américas, com destaque para as espécies D. virgifera, D. undecimpunctata, D. balteata e D. speciosa. Estima-se que apenas nos Estados Unidos, as Diabrotica spp. sejam responsáveis por perdas anuais superiores a US$ 1 bilhão apenas em plantações de milho (GRAY
et al., 2009). A D. speciosa é a espécie predominante do gênero Diabrotica na América do Sul (ÁVILA e SANTANA, 2013), se alimentado principalmente de raízes e tubérculos na fase larval, estando entre as principais pragas de culturas como batata, trigo, milho e outros cereais (VIANA, 2010). Quando adulta apresenta uma alta polifagia, sendo capaz de atacar mais de 300 plantas hospedeiras de mais de 50 famílias, incluindo diversas plantações de interesse econômico como feijão, cana- de-açúcar, batata, trigo e milho (EBEN e MONTEROS, 2013; WALSH et al., 2013). Dentre os insetos do gênero, existem descrições de micro-organismos associados para todas as outras espécies economicamente importantes, D. undecimpunctata, (TRAN e MARRONE, 1988), D. barberi (PRISCHMANN et al., 2008), D. balteata (SCHALK
et al., 1987; PRISCHMANN et al., 2008) e D. virgifera (PRISCHMANN et al., 2008; CHU et
al., 2013), onde nesta última a sua microbiota é responsável por conferir resistência a métodos de controle. Entretanto ainda não existe na literatura relatos sobre a microbiota de D. speciosa. Estas características as tornam um alvo interessante para a exploração de sua microbiota, visto que suas características de plasticidade geográfica e adaptação alimentar podem ter relação com sua diversidade e atividade microbiana.
Diversos são os métodos para se realizar a identificação de micro- organismos isolados, sendo os métodos mais utilizados a avaliação fenotípica, através da comparação de características da formação da colônia como indicativo para classificação; através de coletâneas compreendendo descrições detalhadas (WHITMAN et al., 2012); uso de kits bioquímicos que indicam a capacidade do organismos de utilizar uma série de substratos, bem como reações especificas que indicam qualitativamente a presença ou ausência de sistema enzimáticos (TRUU et
al., 1999) ou, mais recentemente, por técnicas genômicas, que envolvem o sequenciamento de uma ou mais regiões do código genético, entre outros. Estas
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técnicas são capazes de produzir resultados altamente confiáveis, porém nem sempre são eficientes para a caracterização de isolados derivados de fontes ambientais (AWONG-TAYLOR et al., 2008).
Não obstante, apesar da confiança e precisão dos métodos atualmente disponíveis para a identificação bacteriana, o uso do perfil de massas protéico (PMF; Protein Mass Fingerprint) obtido através do uso de espectrometria de massas por ionização por dessorção a laser assistida por matriz acoplada a analisador por tempo de voo (MALDI-TOF MS) tem se tornado um método robusto e confiável para identificação e classificação de micro-organismos (ROSSELLÓ-MÓRA, 2012).
A espectrometria de massas é uma técnica que permite a medição da razão massa/carga (m/z) de moléculas através de processos de ionização e migração de cargas em ambientes controlados. Diversos tipos de fontes de ionização e analisadores foram desenvolvidos desde o começo do desenvolvimento da técnica, no começo do século XIX. Porém, devido ao arranjo experimental dos instrumentos, a grande maioria de suas aplicações estava voltada para a área química (SINGHAL et al., 2015). Entretanto, com o desenvolvimento de tecnologias de ionização branda como electrospray (ESI) e MALDI, houve um grande aumento nas possiblidades de análises, incluindo a aplicação da técnica para moléculas biológicas como proteínas e células inteiras.
As amostras celulares são preparadas para a ionização pela mistura ou recobrimento com uma solução de um composto orgânico eficiente na absorção de energia, chamado de matriz, sendo utilizadas geralmente moléculas orgânicas de baixa massa molecular contendo grupos ácidos e sistemas conjugados, como derivados de ácidos cinâmico e benzoico (HARVEY, 2015). Ao secar, a amostra em contato com a solução também cristaliza, resultando num sólido que pode ser ionizado pela ação de um laser. A ionização e dessorção provocada pelo laser geram íons na matriz que transferem suas cargas para as moléculas, que são então acelerados através de um potencial fixo, sendo separados no espaço através de sua m/z. Em analisadores de TOF, a m/z é medida pela determinação do tempo que cada íon leva para atravessar o tubo de voo e alcançar o detector. Baseado na informação obtida pelo TOF, um espectro característico de PMF é gerado. A identificação dos micro-organismos por MALDI-TOF MS é feita pela comparação do espectro gerado com um banco de dados construídos com espécies já identificadas
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por outros métodos. Para a identificação, geralmente é utilizado uma extensão de m/z de 2-20 kDa, contendo principalmente proteínas ribossomais, as quais que representam 60-70% da massa seca de uma célula bacteriana neste intervalo de massa. (MURRAY, 2012). A Figura 4.1 exemplifica o processo de geração e detecção dos íons, bem como um espectro comumente esperado após uma análise.
FIGURA 4.1 - Representação esquemática do funcionamento da técnica de MALDI- TOF MS e exemplo de espectro de massas obtido (Adaptado de CROXATTO et al., 2012)
De fato, a técnica de MALDI-TOF MS é capaz de fornecer resultados em nível de subespécie microbiana em diversos nichos, que incluem controle de qualidade de alimentos, ecologia química, estudos de microbiomas, identificação de patógenos, etc. (FERREIRA et al., 2011; KERN et al., 2014; LAU et al., 2014; SAMB-BA et
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poucas horas, contrastando com a necessidade de várias horas, ou mesmo dias, para a identificação através de técnicas genéticas convencionais, sendo que os custos associados com as análises espectrométricas podem ser de apenas um quinto do preço das análises de sequenciamento (SENG et al., 2009, 2010; BISWAS e ROLAIN, 2013).
Além de auxiliar na identificação das espécies, as técnicas de caracterização permitem agrupar os organismos de acordo com as similaridades. As sequencias de nucleotídeos da região do gene 16S rDNA são muito utilizadas para identificação pois possuem regiões extremamente conservadas que indicam uma possível relação evolutiva entre as espécies, bem como regiões hiper-variáveis que fornecem poder de discriminação suficiente para se realizar a distinção de espécies dentro de um gênero (JANDA e ABBOTT, 2007). Estas sequencias também são utilizadas para obter informações relacionadas a classificação taxonômica através de dados filogenéticos. A similaridade entre as sequencias pode ser usada para se construir uma arvore filogenética que indica a relação evolutiva entre os organismos avaliados.
Da mesma forma, a combinação de análises de MALDI-TOF MS com técnicas de agrupamento dos resultados de classificação microbiana permite uma classificação taxonômica similar à filogenia, obtida por técnicas genéticas como sequenciamento da região 16S rDNA. Entretanto, como o MALDI-TOF produz uma coleção de perfis proteômicos ao invés de sequencias de regiões conservadas do DNA (como no sequenciamento), diferentes conjuntos de agrupamento podem ocorrer. Esta relação filoproteômica (CONWAY et al., 2001) em particular pode gerar novas compreensões das similaridades existentes entre organismos relacionadas a sua função ecológica e atividades (ecotipos), ao contrário de relações evolucionárias, além de conhecimento sobre possíveis transferências de gene horizontais e classificação polifásica de micro-organismos (KÄMPFER e GLAESER, 2012; OBERBECKMANN et al., 2011).
Portanto, para se obter mais informações sobre o microbioma de D speciosa e identificar os isolados que serão avaliados frente ao seu potencial biotecnológico, essa etapa do trabalho teve por objetivo realizar a identificação dos micro-organismos isolados de D. speciosa usando MALDI-TOF MS e sequenciamento parcial do gene 16S rDNA.
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