Para confirmar a utilidade do teste qualitativo de identificação de bactérias produtoras de PHAs, oito isolados foram selecionados para avaliação quantitativa em meio líquido. As cepas selecionadas estão descritas na Tabela 5.3.
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TABELA 5.3 - Isolados bacterianos selecionados para a avaliação quantitativa em experimentos de produção de PHA.
Isolados selecionados
Aurantimonas sp. (DsA.N042) (++) Kluyvera sp. (DsF.N019) (+)
Burkholderia sp. (DsF.N013) (+) Ochrobactrum intermedium (DsA.N019) (-)
Delftia sp. (DsA.N049) (++) Serratia marcescens (DsA.N004) (++)
Empedobacter brevis (DsF.N002) (-) Stenotrophomonas maltophilia (DsA.N028) (-)
Foram selecionados isolados de todos os grupos observados no ensaio quantitativo (-, + e ++), com o objetivo de determinar a eficiência do método com corante Vermelho do Nilo. Após o cultivo das cepas e a realização dos processos de extração e purificação, foi avaliado o peso em massa seca das células microbianas, bem como do polímero extraído. Os valores obtidos estão descritos na Tabela 5.4.
Pode se observar na Tabela 5.4 uma enorme variação tanto para peso em massa seca como para porcentagem de acumulação de PHA. De maneira geral os isolados apresentaram baixa produção de células quando cultivadas em apenas um estágio, pois o inoculo foi adicionado diretamente em um meio desbalanceado, pobre em nutrientes essenciais. Esta condição de stress é importante para a ativação do metabolismo de acúmulo de PHA intracelular em células microbianas, todavia pode acarretar na diminuição da capacidade do micro-organismo se desenvolver. Apenas o gênero Delftia não demonstrou problemas em se desenvolver e apresentou produção celular elevada em relação às demais.
Com relação ao acúmulo de PHA, os resultados foram relativamente compatíveis com os apresentados pelo teste qualitativo, mostrando que o teste foi útil na rápida identificação de potenciais cepas isoladas na produção de PHA. A única exceção foi a bactéria Serratia marcescens, que não apresentou alta produção de PHA apesar de apresentar alta fluorescência no teste qualitativo. Esta espécie não é descrita como um micro-organismo produtor de PHA em revisões que classificam os micro-organismos produtores (CHODAK, 2008; KOLLER et al., 2010; TAN
et al., 2014). Esse resultado obtido para S. marcescens pode ser resultado da interação e acúmulo do corante causado por outras moléculas apolares produzidas em alta quantidade que não o PHA (TAN et al., 2014), ou então uma mudança de metabolismo provocada pelas diferentes condições de crescimento fez com que o
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acúmulo de PHA observado nos teste qualitativo em meio sólido não fosse reproduzido durante o cultivo em meio líquido nas condições avaliadas neste trabalho. Vale destacar o grande acúmulo de PHA pelos isolados de Aurantimonas e Delftia, produzindo cerca de 50% e 90% do peso em massa seca de PHA respectivamente, mesmo quando inoculada diretamente em meio pobre de nutrientes.
TABELA 5.4 - Avaliação quantitativa da produção de massa celular e polímero pelos isolados selecionados
Organismo Peso em massa seca (g.L-1) (% da massa seca) PHA Vermelho do Nilo
Stenotrophomonas maltophilia 0,27 ± 0,12 2,0 ± 0,4 % - Empedobacter brevis 0,10 ± 0,08 5,0 ± 1,2 % - Ochrobactrum intermedium 0,20 ± 0,10 5,9 ± 2,1 % - Serratia marcescens 0,07 ± 0,05 8,2 ± 4,3 % ++ Kluyvera sp. 0,14 ± 0,02 10,4 ± 3,0 % + Burkholderia sp. 0,03 ± 0,01 12,2 ± 4,9 % + Aurantimonas sp. 0,02 ± 0,01 50,0 ± 9,7 % ++ Delftia sp. 0,49 ± 0,10 89,8 ± 5,3 % ++
Após a obtenção dos materiais secos e a avaliação da produção celular e de polímero, foi realizada a metanólise para identificação da composição dos monômeros em cada isolado. Foi realizada a metanólise direto das células secas, para avaliação da capacidade de aplicação da técnica mesmo sem a necessidade de extração do polímero. Após a reação concomitante de extração e derivatização ocorrida nas condições experimentais, foi feita a injeção da fração orgânica para análise por GC-MS. Nesses ensaios espera-se observar os derivados metilados dos monômeros componentes de PHAs de cadeia curta. Polímeros contendo (R)-3- hidroxibutirato devem conter a molécula (R)-3-hidroxibutanoato de metila (3-HBMe). Por sua vez, polímeros contendo (R)-3-hidroxivalerato deve também apresentar a molécula (R)-3-hidroxipentanoato de metila (3-HPMe) respectivamente (Figura 5.6). Os cromatogramas obtidos estão na Figura 5.8.
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A)
B)
FIGURA 5.8- Cromatogramas obtidos após metanólise das células. A) Cromatograma de íons totais (TIC). B) Ampliação da região entre 4,0 e 7,0 min, com destaque para os sinais dos compostos 3-HBMe (T.R. 4,26min) e 3-HPMe (T.R. 6,12 min)
O cromatograma de íons totais mostra a presença de uma grande quantidade de compostos. Os produtos 3-HBMe e 3-HPMe podem ser observados com tempos de retenção de 4,26 e 6,12 min respectivamente. Para facilitar a identificação dos compostos, foi utilizado dois controles positivos de polímeros com
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composição conhecida contendo 100% PHB ou uma blenda de PHBV contendo aproximadamente 90% butirato / 10% valerato, que também foram submetidos a derivatização por metanólise. Também foi realizada a derivatização sem a presença de células, bem como a injeção apenas do solvente orgânico usado na etapa de extração como controles negativos para avaliar possíveis interferentes. A
Figura5.9 apresenta as fragmentações observadas para as moléculas 3-HBMe e 3-HPMe, bem como as propostas de mecanismos de fragmentação que levam aos principais íons observados.
Para ambas moléculas, podem ser observadas perdas por mecanismos tradicionais, como por clivagem α e rearranjo de McLafferty. Outros íons não descritos podem ser confirmados a partir de perdas secundárias, como por exemplo o íon m/z 71 que é descrito na literatura como sendo derivado da perda de metanol (CH3OH, 32 Da) do íon de m/z 103 (DE RIJK et al., 2005). O solvente apresentou poucos interferentes na região de eluição dos compostos de interesse, entre 4,0 e 7,0 minutos, não prejudicando a interpretação da análise. A avaliação do branco da reação mostrou a presença de um sinal intenso com tempo de retenção em 4,35 minutos, bem próximo à janela de observação do monômero 3-HBMe. Este sinal foi identificado através do banco de dados como sendo a molécula dimetil sulfato, produzida pela reação paralela de metoxilação da molécula de ácido sulfúrico por metanol. Avaliando-se os cromatogramas de todos os isolados, somente foi possível identificar a presença do monômero 3-HBMe para os gêneros Aurantimonas e Delftia. Para todos os outros isolados, não foi possível se identificar a presença de moléculas que fossem de alguma maneira relacionada a monômeros de polihidroxialcanoatos. Esses resultados de GC-MS são condizentes aos ensaios qualitativos nas amostras de Aurantimonas e Delftia, e novamente reforça a observação da capacidade de produção destes isolados.
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FIGURA 5.9 - Espectro de massas e propostas de fragmentações para as moléculas: A) 3-HBMe, e; B) 3-HPMe
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Os cromatogramas apresentaram outros sinais, derivados de outros componentes celulares e reações paralelas. Além dos monômeros 3-HBMe e 3- HPMe, pode ser observado o produto da reação paralela de desidratação do 3- HBMe, 2-butenoato de metila, o éster metílico do ácido crotônico, com T.R. 11,27 min. A existência do produto em pequena quantidade indica uma condição favorável à reação de metoxilação. Também foi possível identificar algumas classes de compostos derivados dos micro-organismos, sendo identificados os ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME; Fatty Acid Methyl Esters) provavelmente originário de paredes celulares microbianas, especialmente de lipopolissacarídeos (LPS) de bactérias gram-negativas. Estas moléculas estão presentes em abundância e são comumente utilizadas como marcadores moleculares de espécie, uma vez que as variações qualitativas e quantitativas destes compostos são particulares de cada espécie bacteriana, sendo inclusive possível realizar a identificação de micro-organismos de maneira similar às técnicas moleculares e espectrométricas (LU e HARRINGTON, 2010). Entre 11,2 e 22,6 min, foi observada a presença de diversos FAMEs, variando entre oito a vinte dois átomos de carbono em sua estrutura lipídica. Dentre os FAMEs foram observadas diversas estruturas como saturados, insaturados, ramificados, hidroxilados e epoxidados. Além disso, também foram encontrados alguns compostos aromáticos, como dimetil benzaldeído (T.R. 10,60 min) e 2,6-dimetoxi-p-benzoquinona (T.R. 15,43 min). Outra classe de sinais característicos identificados foi ésteres metílicos de ácidos orgânicos de cadeia curta (SCFA; short-chain fatty acids), sendo encontrados os derivados metilados do ácido pirúvico (T.R. 6,02 min), ácido levulínico (T.R. 6,70 min), ácido succínico (T.R. 7,50 min) e ácido adípico (T.R. 10,95 min). Estas pequenas moléculas são consideradas grandes promissoras como blocos de construção químicos derivados de fontes renováveis, também conhecidos como químicos de plataforma (PERLATTI et al., 2014) e fortalecem a hipótese da exploração de micro-organismos de biomas subexplorados como bactérias do trato digestivo de insetos na identificação de novas cepas para uso em processos biotecnológicos.
Esses resultados deixam em evidência que as cepas de Aurantimonas e Delftia são espécies microbianas com potencial para produção de biopolímeros. Além disso, ficou evidente a compatibilidade e exatidão entre os testes quali e quantitativos, indicando que o método de triagem usando Vermelho de Nilo pode ser considerado eficiente para selecionar cepas promissoras na produção de PHA. Com
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base nesses resultados, as cepas de Aurantimonas sp. e Delftia sp. foram selecionados para testes posteriores.