Screening for PALB2 mutations

O óleo essencial de copaíba extraído pelo método de hidrodestilação apresentou um rendimento de aproximadamente 10% em relação ao óleo-resina utilizado para extração, indicando que a fração volátil compõe uma parcela do óleo de copaíba. O percentual de óleo essencial obtido a partir do óleo-resina foi superior ao encontrado em outro estudo desta mesma espécie (Copaifera langsdorffii), em que o rendimento foi de aproximadamente 7,3% (GRAMOSA; SILVEIRA, 2005). Sendo assim, esse resultado nos permite sugerir que os parâmetros utilizados na metodologia de extração foram significantes para obtenção de um bom rendimento na extração do óleo essencial a partir de óleo-resina de copaíba.

As análises dos óleos de copaíba demonstraram que os compostos terpênicos presentes apresentam menor tempo de retenção no óleo-resina de copaíba, quando comparados aos mesmos compostos no óleo essencial de copaíba (Figura 9), de modo que pode ser observado um deslocamento de todos os picos para a direita. Estes picos característicos dos compostos terpênicos podem ser observados em diversos estudos que analisaram a constituição química de óleos de copaíba (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002; BARRETO JÚNIOR et al., 2005).

Além do deslocamento dos picos foi possível observar uma melhor resolução dos sinais no óleo essencial de copaíba (Figura 9). Essa separação dos sinais pode ter ocorrido devido às temperaturas menos elevadas utilizadas no processo, ocasionando dessa forma o aumento no tempo de retenção e possibilitando uma melhor resolutividade dos picos (BARTLE; MYERS, 2002).

Figura 9 - Cromatograma obtido por CG-EM. A: óleo-resina de copaíba; B: óleo- resina de copaíba metilado; C: óleo essencial de copaíba; D: óleo essencial de copaíba metilado; E: fração resina metilada do óleo de copaíba obtido como resíduo da extração de óleo essencial. (Fonte: autoria própria).

Para que fosse possível visualizar melhor os picos cromatográficos de componentes ácidos presentes nas amostras, foi realizada a metilação dos óleos de copaíba. Com essa técnica foi possível identificar a presença de ácidos graxos, visto que os ésteres formados foram melhor visualizados (BIAVATTI et al., 2006). Porém, a metilação proporcionou a variação da porcentagem dos hidrocarbonetos terpênicos, já que através da metilação há formação de diferentes hidrocarbonetos (BIAVATTI et al.,

2006). Assim, a metilação mostrou-se de grande utilidade na investigação de diterpenos ácidos, assim como ácidos graxos.

Conforme observado após a metilação do óleo de copaíba e da fração resinosa, permitiu-se a formação de dois grupos de picos cromatográficos, visto que após a metilação, é possível detectar com mais facilidade os terpenos ácidos, responsáveis pelo segundo grupo de picos cromatográficos (Figuras 9).

Conforme demonstrado, o óleo de copaíba exibiu o primeiro grupo de picos no intervalo de 7 a 14 minutos e o segundo grupo entre 21 a 30 minutos (Figura 9). Estas faixas de tempo entram em concordância com o que está descrito para o óleo de copaíba em estudos de revisão deste gênero, ressalvando pequenas variações que podem ser ocasionalmente geradas pela diferença de espécies, conservação da amostra, do processo de extração ou ainda do equipamento (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002).

Por outro lado, o óleo essencial metilado não apresentou o mesmo comportamento das amostras anteriores (Figura 9). Sabendo-se que o óleo essencial contém principalmente hidrocarbonetos terpênicos, não há a evidente formação de um segundo grupo de picos cromatográficos. Em contrapartida, o resíduo resinoso obtido após extração do óleo essencial, apresenta poucos compostos sesquiterpênicos restantes e maior quantidade de terpenos ácidos (segundo grupo de picos) (Figura 9).

As análises dos cromatogramas do óleo-resina de copaíba sugerem que o - bisaboleno foi o composto majoritário identificado. Essa informação pode ser melhor visualizada na Tabela 1, que demonstra além do composto majoritário, outros componentes. O -cariofileno e α-bermagoteno são os outros componentes que demonstram apresentar maior percentual. A porção resinosa obtida como resíduo após extração do óleo essencial apresentou menor quantidade de componentes sesquiterpênicos que o óleo-resina e o óleo essencial, além disso, outros componentes não se mostraram mais presentes, conforme exibido na Tabela 1.

O óleo essencial apresentou um aumento relativo na concentração de alguns componentes presentes na sua constituição. Essa característica deve-se ao fato de que os sesquiterpenos concentram-se na porção volátil, restando menor quantidade no resíduo resinoso. Entretanto, tem sido observado que existe uma extensa variabilidade na composição dos óleos essenciais de copaíba de uma mesma espécie, inclusive quando extraído de diferentes porções da planta.

Tabela 1 - Porcentagem dos compostos terpênicos majoritários das amostras de Copaíba (Copaifera langsdorffii).

TR (min): Tempo de retenção em minutos; OC: Óleo de copaíba; mOC: Óleo de copaíba metilado; mRC: Fração resina de copaíba metilada; OEC: Óleo essencial de Copaíba; mOEC: Óleo essencial de copaíba metilado.

Nascimento et al (2012) realizaram um estudo da composição química de diferentes amostras de óleos essenciais de Copaifera langsdorffii extraídos das folhas,

Composição química TR

(min) OC mOC mRC

TR

(min) OEC mOEC

δ-elemeno 6,90 0,37 0,15 - 21,17 0,63 0,47 (+)-ciclosativeno 7,52 0,45 0,16 - 22,31 0,67 0,45 α-copaeno 7,66 0,93 0,35 0,06 22,76 1,39 1,08 β-elemeno 7,92 1,44 0,61 0,17 23,46 2,41 1,93 β-cariofileno 8,57 18,30 7,72 2,34 24,62 21,68 21,14 α-bergamoteno 8,74 15,61 6,97 2,26 25,29 20,53 18,90 α-guaieno 8,83 1,17 0,51 0,20 25,38 0,88 0,95 β-farneseno 9,03 1,61 0,75 0,30 26,11 1,56 1,66 α-cariofileno 9,22 2,80 1,25 0,53 25,95 2,85 2,82 τ-muuroleno 9,60 0,82 0,38 0,20 26,88 0,53 0,50 β-cubebeno 9,75 4,83 2,25 0,99 27,06 1,72 3,12 β-selineno 9,88 4,34 2,03 1,10 27,27 6,16 5,55 α-selineno - - - - 27,62 2,31 2,62 τ-gurjeneno - - - - 27,78 0,89 0,56 β-camigreno 10,04 5,63 2,72 1,52 - - - β-bisaboleno 10,21 24,76 12,13 7,14 28,24 23,67 24,26 β-sesquifelandreno 10,55 2,44 1,19 0,82 - - - α-curcumeno 12,29 0,35 0,17 0,20 - - - α-cedreno 12,85 0,53 0,07 0,08 - - - β-cedreno - - - - 28,76 1,40 2,12 α-himacaleno 13,01 1,74 - - 33,39 0,46 0,43 Caureno 20,98 0,39 0,23 0,31 - - -

para obter este componente volátil. Pode ser observado que não há uma manutenção nas proporções dos componentes no óleo essencial quando se compara as diferentes fontes de obtenção do mesmo. Outros estudos com a espécie C. langsdorffii demonstraram concordância na presença da maioria dos componentes aqui apresentados, porém, foram observadas algumas divergências em relação aos componentes majoritários, estas podem ter sido apresentadas em decorrência da origem da amostra, data e condições climáticas na época de extração deste óleo-resina (GELMINI et al., 2013).

O cromatograma do óleo de rã-touro apresentou poucos picos bem definidos, mostrando a prevalência de poucos compostos isolados (Figura 10), evidenciando que a análise direta de ácidos graxos não possibilita uma boa resolução de picos e separação ideal dos componentes.

Figura 10 - Cromatograma obtido por CG-EM. A: óleo de rã-touro; B: óleo de rã- touro metilado. (Fonte: autoria própria).

O processo de metilação o qual foi submetido o óleo rã-touro propiciou a melhor separação dos picos, bem como revelou a presença de ácidos graxos em sua forma esterificada que não haviam sido identificados anteriormente (Figura 10).

O método de metilação de óleo de rã-touro foi utilizado previamente por Mendez et al (1998) e foi demonstrado que a derivatização dos ácidos graxos favorecem sua melhor separação e identificação. Assim como no estudo de Mendez et al (1998), os derivados do ácido oléico foram os compostos predominantes na amostra de óleo de rã- touro estudada, além da predominância de derivados do ácido palmítico e linoléico. Sendo estes três, os ácidos graxos monoinsaturados, saturados e polissaturados predominantes, respectivamente na amostra.

Na tabela abaixo é possível observar que o monooleato de glicerila apresenta-se como composto majoritário das amostras de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw). Após processo de metilação da amostra, componentes esterificados com a adição de grupamento metila foram encontrados, dentre eles, palmitoleato de metila, palmitato de metila, linoleato de metila e oleato de metila. Conforme mencionado anteriormente, estes ésteres encontrados após metilação correspondem aos ácidos graxos presentes no óleo de rã-touro.

Tabela 2 - Porcentagem dos compostos majoritários das amostras de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw)

Composição química TR (min) OR mOR

Palmitoleato de metila 18,25 - 2,23 Palmitato de metila 18,65 - 5,87 Linoleato de metila 21,84 - 4,79 Oleato de metila 21,94 - 9,26 1,2-dipalmitoil de glicerol 25,32 15,31 - Monooleato de glicerila 28,22 55,08 7,59

TR (min): Tempo de retenção em minutos; OR: Óleo de rã-touro; mOR: Óleo de rã- touro metilado.

Estes resultados também se encontram em conformidade com o que foi observado por Lopes et al. (2010), que realizaram diferentes metodologias de extração de óleo de rã-touro e também observou a predominância dos ácidos oléico, linoléico e palmítico através da presença de seus ésteres.