Os fatores de virulência, que são grandes responsáveis pelos baixos prognósticos conferidos a pacientes com infecções bacterianas ou fúngicas, devem ser estudados a fim de verificar a influência do uso de emulsões de óleos terapêuticos na diminuição destes fatores.
Nesse estudo foram desenvolvidos biofilmes constituídos por comunidades de micro-organismos acumulados nas superfícies, arranjados tridimensionalmente e integrados a uma matriz polimérica extracelular (MARSH, 2006). Este estudo torna-se importante devido ao desenvolvimento de biofilmes promoverem modificações fenotípicas nos micro-organismos quando comparados àqueles na forma individualizada, e na maioria dos casos, essa mudança confere uma maior resistência aos antimicrobianos e aos fatores de defesa do sistema imunológico do hospedeiro (ARCIOLA et al., 2012).
A avaliação da inibição de biofilme foi realizada com as amostras de óleo de copaíba e óleo de rã-touro e suas emulsões. As emulsões de óleo-resina e de óleo essencial de copaíba mostraram-se efetivas na diminuição da formação de biofilme frente a algumas das cepas em estudo. Quando comparamos as atividades das emulsões dos óleos de copaíba, observa-se uma semelhança na ação frente a maioria das cepas, porém houve um decréscimo significativo (p < 0,05) na formação de biofilme das cepas S. aureus ATCC 29213 e S. epidermidis ATCC 12228 pela emulsão de óleo essencial, em contrapartida, a cepa C. krusei LMMM54 (AC) foi mais sensível à ação da emulsão de óleo-resina.
Adicionalmente, a emulsão do óleo essencial de copaíba demonstrou uma melhor ação antibiofilme que o Cetoconazol contra a cepa de referência de C. krusei ATCC 6258. Este resultado pode estar ligado à resistência intrínseca que as cepas de C. krusei possuem aos azólicos, especialmente fluconazol, porém devido a estrutura química semelhante, pode haver resistência cruzada dos micro-organismos frente aos antifúngicos (Figura 16).
Figura 16 - Formação de biofilme na presença de óleos de copaíba e emulsões contendo estes óleos. OC: Óleo de copaíba; EOC: Emulsão de óleo de copaíba; OEC: Óleo essencial de copaíba; EOEC: Emulsão de óleo essencial de copaíba; Clor/Cet: Cloranfenicol e Cetoconazol como antimicrobiano de referência para bactérias e fungos, respectivamente; CP: Controle positivo, sem antifúngico. (Fonte: autoria própria).
As análises da formação de biofilme na presença das amostras de óleo de rã- touro e emulsão demonstraram uma significante atividade inibitória contra todas as leveduras quando comparados ao Cetoconazol, provavelmente porque as pequenas gotículas de óleo promovem uma melhor interação com a membrana fúngica e melhoram a ação farmacológica contra estes micro-organismos (Figura 17).
A inibição da formação de biofilme causada pela emulsão do óleo de rã-touro frente à cepa de P. aeruginosa mostrou uma significante atividade quando comparada a inibição provocada pelo Cloranfenicol. Para esclarecer o mecanismo de ação do óleo de rã-touro frente à P. aeruginosa será necessária a realização de outras analises.
Figura 17 - Formação de biofilme na presença de óleo de rã-touro e emulsão contendo este óleo. OR: Óleo de rã-touro; EOR: Emulsão de óleo de rã- touro; Clor/Cet: Cloranfenicol e Cetoconazol como antimicrobiano de referência para bactérias e fungos, respectivamente. (Fonte: autoria própria).
Adicionalmente, os micro-organismos mais responsivos À ação antibiofilme da emulsão de óleo de rã-touro foram cepas de Candida, dentre elas, C. glabrata and C. krusei, que são pouco sensíveis e resistentes aos antifúngicos azólicos, respectivamente. Assim, sugere-se que este sistema pode ser utilizado na terapia de infecções desencadeadas por formação de biofilme causado por fungos do gênero Candida, que são responsáveis por cerca de 80% das infecções fúngicas em ambiente hospitalar (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003).
Destaca-se com relação à ação antibiofilme da emulsão de óleo de rã-touro, a possibilidade de utilizar um sistema capaz de impedir somente o crescimento de biofilmes e assim, impedir o desenvolvimento de infecções, ou ainda, reduzir quadros infecciosos desenvolvidos pelo crescimento de biofilmes microbianos. Adicionalmente, por não apresentarem atividade antimicrobiana relevante, este sistema combateria a infecção por diminuir a formação de biofilmes e provavelmente não induziria
resistência microbiana devido a sua inexpressiva atividade de inibição do crescimento dos micro-organismos.
É relevante destacar que esta metodologia analisa apenas a formação do biofilme. Sendo assim, não se pode afirmar que os micro-organismos não estão viáveis, somente podendo ser observado a viabilidade se os dados forem comparados com aos valores de CIM obtidos. Porém, sabendo que a redução do biofilme está relacionada com a gravidade da infecção, mesmo que a concentração utilizada para inibir a formação de biofilme seja inferior ao CIM, o sistema exibe uma atividade significativa para tratar indivíduos imunocompetentes sem a necessidade de utilizar um agente antifúngico ou antibacteriano mais potente.
6 CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos, pode-se inferir que o processo de metilação utilizado para derivatizar as amostras de óleo de rã-touro e óleo-resina de copaíba a serem analisadas por CG-EM possibilitou a obtenção de melhores cromatogramas, viabilizando a identificação dos compostos presentes nos óleos. Assim, foi possível verificar que o óleo-resina de copaíba apresentou uma predominância de componentes diterpênicos e sesquiterpênicos, enquanto o óleo de rã-touro apresentou uma composição predominante de ácidos graxos da classe ômega.
O óleo essencial de copaíba concentra os componentes terpênicos presentes no óleo-resina, assim o óleo essencial apresenta uma maior atividade antimicrobiana quando comparado ao óleo-resina para a maioria das cepas, especialmente frente às bactérias do gênero Staphylococcus e às leveduras do gênero Candida que apresentam baixa sensibilidade aos antifúngicos azólicos utilizados atualmente na terapêutica. Os resultados demonstraram também que o óleo de rã-touro não demonstrou uma significante atividade antimicrobiana.
Adicionalmente, foram identificados os principais componentes que exibem atividade antimicrobiana frente às cepas de estudo. Os terpenos α-curcumeno, α- himacaleno, Isotujol e α-fencheno foram identificados na fração antimicrobiana do óleo de copaíba e derivados dos ácidos linoléico, oléico e palmítico foram identificados na fração antimicrobiana do óleo de rã-touro.
As emulsões demonstraram CIM semelhantes ou menores que os óleos puros, demonstrando assim, resultados de grande relevância científica, visto que estes sistemas apresentavam apenas 5 % de óleo em sua composição. Foi possível observar não somente a atividade das emulsões a base de óleo de rá-touro, óleo-resina e óleo essencial de copaíba, mas também foi demonstrada uma potencialização desta atividade, tendo em vista as baixas concentrações inibitórias mínimas obtidas. Destaca-se a atividade da emulsão de óleo essencial de copaíba, que exibiu inibição de crescimento significante para a maioria das cepas testadas.
As emulsões demonstraram significante poder de inibição da formação de biofilmes. Destaca-se a ação da emulsão de óleo de rã-touro, que mesmo não exibindo potencial ação inibidora do crescimento dos micro-organismos testados, foi capaz de inibir o crescimento de biofilme.
Deste modo, baseado na potencial atividade antibiofilme da emulsão de óleo de rã-touro e na expressiva atividade antimicrobiana da emulsão contendo óleo essencial de copaíba, estes sistemas tornam-se alternativas viáveis para futura utilização no tratamento de infeções de pele, especialmente frente a cepas de Staphylococcus e de C. glabrata e C. krusei, que são micro-organismos que vêm exibindo resistência contra muitos antimicrobianos tradicionais utilizados atualmente.
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