Sample preparation of proteins and peptides prior to LC-MS analysis

2.3.7.1. Expressão das proteínas em meio mínimo M9 contendo 15N

A expressão das proteínas marcadas com 15N foi realizada em meio mínimo M9 contendo 15NH4Cl. Células de E. coli da cepa BL21(DE3)pLysS foram

transformadas com os plasmídeos contendo as ORFs em estudo pelo método de CaCl2 (SAMBROOK et al., 2001). As colônias obtidas foram pré-inoculadas em 50

mL de meio 2xTY (16g/L triptona; 10 g/L extrato de levedo; 5 g/L NaCl; pH 7,4). suplementado com 200 μg/mL de ampicilina e 200 μg/mL de cloranfenicol. Após o

crescimento a 37 oC e 200 rpm até a DO600nm = 0,8-1,2, 5 mL desta cultura foram

utilizados para inocular 500 mL de meio mínimo M9 contendo 15NH4Cl e

células foram novamente incubadas a 37 oC, e 200 rpm até D.O.600nm = 0,8 quando

foram induzidas pela adição de 1 mM de ITPG. Após 8 h de indução, as células foram centrifugadas por 20 minutos, a 4 oC e 5000 rpm, ressuspendidas em 25 mL de solução de lise (1 mM EDTA, 25% sacarose, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 14 mM de β-mercaptoetanol e 100 μM de PMSF) e -20 ºC. O nível de expressão foi verificado

através de SDS-PAGE em géis de 15% acrilamida e 0,4% bisacrilamida, aplicando- se as alíquotas do controle e das amostras induzidas.

2.3.7.2. Purificação da proteína XAC2000

As células de E. coli ressuspendidas em tampão de lise e armazenadas a -20

o_{C foram lisadas utilizando French Press}® _{com uma pressão de 16000 psi. O lisado}

obtido foi centrifugado a 5000 rpm a 4 oC por 1 hora. Ao sobrenadante obtido foi adicionado 50% de sulfato de amônio e a mistura agitada em gelo por 30 minutos seguido de centrifugação a 10000 rpm por 30 minutos a 4 ºC. O precipitado obtido após a centrifugação foi ressuspendido em tampão 50 mM Tris-HCl pH 7,0; 1 mM EDTA; 14 mM β-mercaptoetanol e dialisado em membranas com um “cutoff” de 6-8

kDa contra o mesmo tampão. Após a diálise, foi adicionada uréia sólida para uma concentração final de 8 M, e a solução foi aplicada em uma coluna de troca iônica Q- Sepharose-FF (sistema Äkta, Amersham Biosciences). Proteínas ligadas à coluna foram eluídas utilizando um gradiente de eluição de zero a 300 mM NaCl, em tampão 8 M uréia; 50 mM Tris-HCl pH 7,0; 1 mM EDTA; 14 mM β-mercaptoetanol,

em 12 volumes de coluna. As frações obtidas foram analisadas por SDS-PAGE utilizando géis de 15% acrilamida e 0.4% bisacrilamida, e aquelas que continham a proteína XAC2000 foram dialisadas em membranas com um “cutoff” de 12-16 kDa contra 50 mM Tris-HCl pH 7,0; 0,5 mM EDTA; 14 mM β-mercaptoetanol e

precipitadas com 80% de sulfato de amônio. O precipitado obtido foi ressuspendido em 5mL de 50 mM NaH2PO4 pH 7,0; 100 mM KCl; 0,5 mM EDTA; 1 mM DTT e

aplicado em uma coluna de gel filtração Superdex-75 prepgrade (sistema Äkta, Amersham Biosciences) e eluído utilizando 1,5 volumes de coluna do mesmo tampão. As frações puras da proteína XAC2000, verificadas em géis SDS-PAGE, foram dialisadas em membranas com um “cutoff” de 12-16 kDa contra 10 mM NH4CO3 e 14 mM β-mercaptoetanol, congeladas a -80 oC e liofilizadas. O liofilizado

obtido foi armazenado a 4 oC.

2.3.7.3. Purificação da proteína XAC3873

As células de E. coli ressuspendidas em tampão de lise e armazenadas a -20

o

C foram lisadas utilizando French Press® com uma pressão de 16000 psi. O lisado obtido foi centrifugado a 5000 rpm a 4 oC por 1 hora. Ao sobrenadante obtido foi adicionada uréia sólida para uma concentração final de 8 M. Esta solução foi aplicada em uma coluna de troca iônica Q-Sepharose-FF (sistema Äkta, Amersham Biosciences). Proteínas ligadas à coluna foram eluídas utilizando um gradiente de eluição de zero a 300 mM NaCl, em tampão 8 M uréia, 50 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA, 14 mM β-mercaptoetanol, em 12 volumes de coluna. As frações obtidas

foram analisadas por SDS-PAGE utilizando géis de 15% acrilamida e 0.4% bisacrilamida, e aquelas que continham a proteína de interesse foram dialisadas em membranas com um “cutoff” de 12-16 kDa contra 50 mM Tris-HCl pH 7,0; 0,5 mM EDTA; 14 mM β-mercaptoetanol e precipitadas com 80% de sulfato de amônio. O

precipitado obtido foi ressuspendido em 5mL de 50 mM NaH2PO4 pH 7,0, 100 mM

KCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT e aplicado em uma coluna de gel filtração Superdex- 75 prepgrade (sistema Äkta, Amersham Biosciences) e eluído utilizando 1,5 volumes

de coluna do mesmo tampão. As frações puras da proteína XAC3873, verificadas em géis SDS-PAGE, foram dialisadas em membranas com um “cutoff” de 12-16 kDa contra 10 mM NH4CO3 e 14 mM β-mercaptoetanol, congeladas a -80 oC e

liofilizadas. O liofilizado obtido foi armazenado a 4 oC.

2.3.7.4. Purificação da proteína XAC2396

As células de E. coli ressuspendidas em tampão de lise e armazenadas a -20

o

C foram lisadas utilizando French Press® com uma pressão de 16000 psi. O lisado obtido foi centrifugado a 5000 rpm a 4 oC por 1 hora. O sobrenadante obtido foi precipitado com 75% etanol, deixado em gelo por duas horas e centrifugado novamente por mais 15 min. O novo sobrenadante foi novamente precipitado com 75% etanol e 14 mM β-mercaptoetanol e centrifugado nas mesmas condições por

mais 20 min. O precipitado final obtido foi ressuspendido em 50mL de 50 mM Tris- HCl pH 7,5, 1M KCl, 14 mM β-mercaptoetanol e 0,1 mM de PMSF, submetido a

banho de gelo sob agitação lenta por 4 horas e centrifugado novamente a 5000 rpm a 4 oC por 20 min. O precipitado obtido foi ressuspendido em 50 mM Tris-HCl pH 7, 14 mM β-mercaptoetanol, 1 mM EDTA e 8M uréia e aplicado em uma coluna de

troca iônica Q-Sepharose-FF (sistema Äkta, Amersham Biosciences). Proteínas ligadas à coluna foram eluídas utilizando um gradiente de eluição de zero a 300 mM NaCl, em tampão 8 M uréia, 50 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA, 14 mM β-

mercaptoetanol, em 12 volumes de coluna. As frações obtidas foram analisadas por SDS-PAGE utilizando géis de 15% acrilamida e 0.4% bisacrilamida, e aquelas que continham a proteína de interesse foram dialisadas em membranas com um “cutoff” de 12-16 kDa contra 50 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA, 14 mM β-mercaptoetanol

ressuspendido em 5mL de 50 mM NaH2PO4 pH 7,0, 100 mM KCl, 0,5 mM EDTA, 1

mM DTT e aplicado em uma coluna de gel filtração Superdex-75 prepgrade (sistema Äkta, Amersham Biosciences) e eluído utilizando 1,5 volumes de coluna do mesmo tampão. As frações puras da proteína XAC2396, analisadas por SDS-PAGE utilizando géis de 15% acrilamida e 0.4% bisacrilamida, foram dialisadas em membranas com um “cutoff” de 12-16 kDa contra 50 mM Tris-HCl pH 7,0 e foram armazenadas a -20 ºC. Esta proteína foi purificada em colaboração com a aluna Cristiane Rodrigues Guzzo.

2.3.7.5. Purificação das proteínas XAC0862 e XACb0070

As proteínas XAC0862 e XACb0070 foram purificadas pela aluna Ângela Mika Katsuyama utilizando métodos convencionais de lise por French Press®, precipitação por sulfato de amônio, cromatografia de troca iônica e gel filtração de forma análoga ao descrito para as demais proteínas.

2.4. RESULTADOS