3. RESULTS AND DISCUSSION
3.2 Targeted protein analysis of DBS
3.2.2 Sample preparation of proteins from DBS
A seleção de proteínas alvo é um passo estratégico em um projeto de proteômica estrutural pois a seleção das proteínas alvo apropriadas é crucial para o sucesso do projeto. O nosso objetivo foi selecionar 35 ORFs de Xac que codificassem proteínas hipotéticas conservadas (função e estrutura desconhecidas) cujas estruturas pudessem fornecer informações sobre funções de famílias de proteínas conservadas, revelar novos padrões de enovelamento protéico (“folds”) e contribuir para o entendimento deste fitopatógeno a nível molecular. O processo de seleção de proteínas alvo para um projeto de proteômica estrutural é um processo laborioso que requer uma análise detalhada de todo o genoma. Em primeiro lugar, é necessário selecionar um número considerável de proteínas alvo para se obter um número reduzido de estruturas tridimensionais, pois muitas das proteínas selecionadas são eliminadas no decorrer do processo por não se mostrarem apropriadas. Em geral, nos casos descritos na literatura, observa-se uma “taxa de sucesso” de obtenção de estrutura tridimensional em projetos de proteômica estrutural de aproximadamente 10% a 20% (MITTL E GRÜTTER, 2001; YEE et al., 2002; LESLEY et al., 2002; PETI et al., 2004; PAGE et al., 2005; Ó’TOOLE et al., 2004b). Assim, ao selecionarmos 35 proteínas alvo estávamos aumentando as chances de obtermos pelo algumas estruturas tridimensionais para as proteínas selecionadas.
Foi também necessário certificarmo-nos de que durante o processo de seleção não seriam escolhidas proteínas que fossem ser impossíveis de estudar por cristalografia de raios-X ou RMN, como por exemplo proteínas transmembranares, ou proteínas muito grandes (BRENNER, 2000). Assim, foram selecionadas apenas
proteínas com tamanho inferior a 300 amino ácidos e cuja localização celular predita fosse o citóssol (ausência de hélices transmembranares e peptídeos sinal). Para facilitar uma possível análise futura por cristalografia de raios-X, selecionamos também proteínas cujo conteúdo de metioninas fosse superior a 1.1% permitindo assim a eventual expressão de proteínas contendo selenometionina e resolução das fases por MAD (“Multiple wavelegth Anomalous Dispersion”).
Uma vez que ambicionávamos descrever novos padrões de enovelamento protéica e desta forma preencher novo espaço conformacional, priorizamos a escolha de proteínas de função e estruturas desconhecidas, e que fossem também altamente conservadas em vários genomas. O fato de serem proteínas de função e estrutura desconhecidas aumentava grandemente as chances e obtermos uma nova conformação protéica. Por outro lado, o fato de ser uma proteína conservada aumenta grandemente as chances de se tratar de uma proteína de elevada relevância biológica. Vale salientar também que, se a proteína estiver conservada em vários genomas e apresentar homologia ≥ 35% com outras proteínas, é provável
que a estrutura obtida permita estimar a estrutura dos seus homólogos noutras espécies por modelagem por homologia (“homology modelling”) contribuindo assim para o aumento do número total de estruturas protéicas conhecidas. A Figura 5 resume os critérios utilizados para a seleção das proteínas alvo deste projeto. Aproximadamente 200 das proteínas codificadas pelas 4313 ORFs de Xac atendiam aos requisitos descritos acima. A escolha especifica das 35 proteínas alvo para estudos estruturais visou uma representação bastante heterogênea em termos de conservação entre espécies e tamanho das proteínas codificadas. A Tabela 3 apresenta um resumo das características das proteínas selecionadas para este projeto.
Figura 5. Fluxograma esquematizando o processo de seleção das 35 proteínas alvo de Xac para estudos estruturais.
triagem: proteína não expressou nas condições testadas (NX); proteína expressou mas apresentou-se insolúvel nas condições testadas (XI); proteína expressou, apresentou-se solúvel nas condições testadas e foi testada por RMN (XS-RMN). Nas que nas colunas que descrevem proteínas homólogas cujas estruturas se encontram depositadas no PDB apenas o homólogo de maior identidade é mostrado.
ORF Estágio da Triagem No. a.a No. Met. Organismo do homólogo mais próximo (2001) % Id. Hom ól- ogo Função Biológica Predita (2001) Identidade com proteínas depositadas no PDB (em 2001) Identidade com proteínas depositadas no PDB (em 2007) XAC0021 XI 106 2 X. fastidiosa 80 Proteína hipotética
conservada N/A Carbamato Quinase de Enterococcus faecalis (31%) XAC0400 XI 271 6 X. campestris pv. vesicatoria 76
Proteína associada com
patogenicidade (hpa). N/A N/A
XAC0404 NX 204 3 X. campestris
pv. glycines 98
Proteína de função desconhecida associada
como operon hrp.
N/A β-secretase humana (27%) XAC0862 XS-RMN 127 3 X. fastidiosa 73 Proteína do operon pdxA-
DsgA-apaG-apaH N/A
ApaG de Xac (100%) *Estrutura determinada por membros do nosso
grupo
XAC1110 XS-RMN 106 8 X. fastidiosa 88 Proteína hipotética conservada N/A YbaB de E. coli (57%)
XAC1223 XS-RMN 165 3 X. fastidiosa 70 Proteína hipotética conservada N/A
Fosphoribosilpirofosfato Sintetase de Bacillus
subtilis (40%)
XAC1352 XI 166 6 E. coli 60 Proteína hipotética conservada N/A
Uronate isomerase (Tm0064) de
Thermotoga marítima
(29%) XAC1670 NX 124 6 Caulobacter sp 44 regulador de resposta. Proteína com domínio
“Switch” fosforilado de transdução de sinal bacteriano (29%) Domínio ativado ef3receptor de PhoB (34%)
Triagem a.a Met. próximo (2001) ogo ól- Predita (2001) depositadas no PDB (em 2001) depositadas no PDB (em 2007) XAC1747 XI 233 4 Synechocystis sp. 52 Proteína hipotética conservada N/A YhhW de E. coli (45%) XAC1757 XS-RMN 160 3 X. fastidiosa 72 Proteína co-migratoria de
bacterioferritina Triparedoxina peroxidase de C. fasciculate (31%) Triparedoxina peroxidase (Txnpx) de Trypanosoma cruzi (31%) XAC1883 XI 82 2 P. abyssi 40 Proteína de função desconhecida. Associada com um cluster de virulência. Regulador da transcrição ABRB de B. subtilis (35%) Domínio N-terminal do fator de transcrição AbrB
de E. coli (36%) XAC1884 NX 136 5 X. fastidiosa 40 Proteína associada com o cluster rpf. N/A
AmpT de Thermus
thermophilus
(36%) XAC2000 XS-RMN 106 5 X. fastidiosa 71 Proteína hipotética
conservada N/A ClpS de E.coli (54%)
XAC2218 XS-RMN 130 4 X. fastidiosa 70 Proteína hipotética
conservada N/A
Quinohemoproteína Alcool dehidrogenase Adhiig de Pseudomonas
putida (30%)
XAC2237 XS-RMN 233 4 X. fastidiosa 72 Proteína hipotética
conservada N/A
Xantina dehidrogenase de Rhodobacter
capsulatus (33%)
XAC2355 XS-RMN 145 3 X. fastidiosa 80 Proteína hipotética
conservada N/A N/A
XAC2375 XI 229 4 X. fastidiosa 65 Proteína hipotética
conservada N/A N/A
XAC2396 XS-RMN 182 7 E. coli 40 Proteína hipotética conservada N/A
YaeQ de Xac (100%) *Estrutura determinada por membros do nosso
grupo XAC2462 XS-RMN 328 5 X. fastidiosa 77
Proteína que se liga a ATP. Proteína de transporte de maltose.
MALK – Proteína que liga açucar (17%)
Domínio central da ATPase Swi2SNF2 de
Sulfolobus solfataricus
Triagem a.a Met. próximo (2001) ogo ól- Predita (2001) depositadas no PDB (em 2001) depositadas no PDB (em 2007) XAC2573 NX 153 3 Mesorhizobium
sp 44
Proteína associada com o
operon gum. N/A
Proteína hipotética Q8u9w de
A. tumefaciens (46%)
XAC2775 XS-RMN 156 6 X. fastidiosa 74 Proteína hipotética
conservada N/A YbeA de E. coli .(50%) XAC2942 XI 298 3 B. bronchiseptica 64 Proteína hipotética
conservada N/A Fator de Iniciação de replicação de DNA (23%) XAC2956 XS-RMN 233 2 X. fastidiosa 70 Proteína relacionada à replicação. Proteína que se liga a
DNA. T. maritime RUVBA156S (mutante) (16%) T. maritime RUVBA156S (mutante) (16%)
XAC3069 XS-RMN 244 3 X. fastidiosa 61 Proteína hipotética conservada N/A N/A XAC3146 XS-RMN 152 6 X. fastidiosa 73 Proteína associada com o
cluster tol. 4-hydroxibenzoil coA tioesterase de Pseudomonas sp (21%) Hypothetical Protein Ec709 From Escherichia Coli 44 XAC3151 XI 242 8 X. fastidiosa 78 Proteína hipotética
conservada N/A YebC de E. coli (56%)
XAC3410 XS-RMN 147 5 X. fastidiosa 75 Proteína hipotética
conservada N/A
Proteína hipotética conservada de
Pseudomonas Syringae
Psr62 (51%) XAC3671 XS-RMN 161 2 P. aeruginosa 54 Proteína hipotética
conservada N/A YajQ de E. coli (46%) XAC3725 XS-RMN 168 2 S. typhimurium 69 Proteína hipotética conservada N/A YciF de E. coli (65%)
XAC3726 XI 299 14 P. aeruginosa 67 Proteína hipotética
conservada N/A Manganese catalase de Lactobacillus plantarum (33%) XAC3872 XS-RMN 148 9 X. fastidiosa 72 Proteína hipotética
Triagem a.a Met. próximo (2001) ogo ól- Predita (2001) depositadas no PDB (em 2001) depositadas no PDB (em 2007) XAC4145 XI 167 2 P. aeruginosa 47 Proteína de função desconhecida em um cluster de 7 proteínas hipotéticas conservadas N/A
Proteína co-regulada com hemolisina de P. aeruginosa (41%) XAC4147 XI 169 6 P. aeruginosa 73 Proteína de função desconhecida em um cluster de 7 proteínas hipotéticas conservadas N/A N/A
XAC4330 XI 184 6 N. meningitis 33 Proteína hipotética
conservada N/A Rop4 E. coli (30%)