Como mencionado anteriormente, para um extrato apresentar potencial fitoestrogênico é necessário que ele possua em sua composição uma molécula (ou um conjunto delas) que mimetize a ação do estradiol no sítio de interação do receptor estrógeno (ER), ativando a sinalização celular. Os testes que medem a capacidade do extrato (ou um composto isolado) de simular a ação do estradiol
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recebem o nome de testes de estrogenicidade e podem ser divididos em ensaios in vitro e in vivo.
Os ensaios in vivo são geralmente realizados em ratazanas (Rattus norvegicus e a raça mais utilizada é a Wistar) ovariectomizadas, para que esses
animais não sejam capazes de produzir naturalmente os hormônios ovarianos. O extrato é administrado ao animal e, após um período correspondente a alguns ciclos reprodutivos (ciclo estral), é feita uma análise colpocitológica de esfregaço vaginal. Assim como na mulher, durante o ciclo reprodutivo das ratazanas, ocorre uma oscilação periódica dos níveis de estrogênio no sangue, levando a uma alteração no epitélio vaginal, a qual pode ser detectada pelo esfregaço115. Para a realização de ensaios in vivo é necessária a aprovação prévia de um comitê de ética e os
resultados obtidos são bastante complexos. Além disso, os experimentos requerem um elevado número de animais, que na grande maioria das vezes são mortos em seguida, e os resultados apresentam uma grande variabilidade. Em um estudo para avaliação dos efeitos farmacológicos do Menoprogen®, um medicamento fitoterápico para o tratamento dos sintomas do climatério, Lu e colaboradores não conseguiram observar diferenças morfológicas por microscopia entre o grupo de ratas testes e o grupo controle116. Poucos anos depois, Ma e colaboradores conseguiram observar que o mesmo medicamento promoveu a recuperação da atrofia uterina e da glândula adrenal, além de reestabelecer os níveis de estradiol, estrona e progesterona no sangue117.
Em virtude das implicações relacionadas aos ensaios in vivo, os
ensaios in vitro estão sendo utilizados preferencialmente para as triagens iniciais de
perfil fitoestrogênico de extratos. Os testes bioquímicos são os mais simples de serem executados. Neles, os extratos são testados no alvo isolado, no caso o
ER118,119. Esse tipo de teste fornece apenas uma resposta do tipo “sim ou não”, além
de quantificar a afinidade pelo alvo macromolecular. Como o alvo está isolado, não é possível observar como a interação da molécula com o mesmo está inserida no contexto de sinalização celular. Neste ensaio é possível inferir se haverá uma ação agonista (ativando o receptor) ou antagonista (inibindo a sua ação) por meio de alterações na conformação da hélice 12 do receptor.120 No entanto, isto depende de informações provenientes de métodos biofísicos como cristalografia de raios-X, que não é trivial principalmente para uma mistura de substâncias. Além disso, a informação estrutural por si só não é suficiente para determinar o padrão de
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resposta celular. O raloxifeno é um fármaco modulador seletivo do receptor estrógeno (SERM) de segunda geração que pode atuar como agonista ou antagonista do ER, dependendo do tipo celular no qual o receptor está localizado. Ele atua como agonista regulando a densidade óssea em casos de osteoporose em mulheres na pós-menopausa121 e, por esta razão, é utilizado nas HRTs. Por outro lado, a mesma molécula atua como antagonista do ER em células do tecido mamário, bloqueando a proliferação de células tumorais, com uso na quimioterapia para o câncer de mama122.
Ainda no âmbito dos ensaios in vitro, devido à limitação dos testes
bioquímicos, os ensaios celulares vêm ganhando cada vez mais espaço. Um dos mais utilizados nessa categoria é o E-SCREEN®, teste desenvolvido inicialmente por Soto e colaboradores123 para quantificar a estrogenicidade de xenobióticos e verificar se eles poderiam ter efeito acumulativo ou mesmo causar alterações sexuais em diferentes espécies antes que os mesmos fossem liberados no meio ambiente. Experimentalmente, mede-se a proliferação celular induzida por compostos bioativos presentes nos extratos em comparação àquela obtida pela ação do 17--estradiol em linhagem de células MCF-7, um modelo de células humanas de adenocarcinoma mamário cuja replicação é estimulada pelo hormônio.
As linhagens de células humanas de câncer de mama são classificadas em quatro subtipos principais, conforme a expressão de 3 proteínas biomarcadoras: o receptor estrógeno (ER), o receptor e progesterona (PR) e o receptor do fator de crescimento epidermal HER2/neu. O subtipo que expressa os receptores hormonais (ER+/PR+/HER-) é o mais comum e o de melhor diagnóstico, enquanto o subtipo que não expressa qualquer um dos três marcadores (ER-/PR-/HER-), também conhecido como triplo negativo, advém do tipo de câncer considerado mais agressivo, o mais difícil de ser diagnosticado e o que menos responde aos tratamentos quimioterápicos124. A linhagem MCF-7 expressa os receptores hormonais, principalmente o receptor estrógeno125. Nesse caso, se uma molécula agonista do receptor estrógeno (como o 17--estradiol) interage com o ER, a replicação será estimulada e levará a um número muito maior de células quando comparada à cultura celular na ausência de agonistas. MCF-7 é uma linhagem que tende a formar colônias durante o crescimento celular, muitas vezes havendo superposição de camadas de célula (FIGURA 1.13).
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FIGURA 1.13 - Culturas de células utilizadas em ensaios in vitro para extratos com
potencial fitoestrogênico
O teste de estrogenicidade é fundamental para avaliar se um extrato é fitoestrogênico. No entanto, para que esse extrato se torne um candidato em potencial para ser utilizado em terapia de reposição hormonal, estudos de seletividade e citotoxicidade são recomendáveis previamente aos estudos in vivo. O
teste de seletividade busca avaliar se o extrato é seletivo ao ER, o qual está diretamente envolvido na modulação da sinalização celular do sistema termorregulatório. Experimentalmente, a avaliação pode ser realizada com base em um modelo de células humanas de adenocarcinoma mamário que não expressem o receptor estrógeno, como a MDA-MB-231. Ao contrário da MCF-7, essa linhagem é do subtipo triplo negativo, pois não expressa qualquer um dos 3 marcadores citados anteriormente. Por essa razão, a replicação celular não é estimulada por hormônios ou por moléculas que mimetizem a ação dos mesmos. Dentre as linhagens triplo- negativas, também conhecidas por subtipo basal, a MDA-MB-231 é uma das mais utilizadas em estudos sobre mutação gênica e metástase126. É uma linhagem que replica rapidamente e preferencialmente em monocamadas (FIGURA 1.13).
Os testes de citotoxicidade são realizados com a finalidade de se investigar se o extrato com potencial fitoestrogênico também apresenta algum efeito tóxico em células sadias. Esse estudo também é feito por meio de ensaios in vitro e
é uma etapa preliminar bastante importante antes de se passar para um estudo in vivo mais complexo, que demandam custo e tempo maiores. Se o extrato apresentar
toxicidade no ensaio in vitro, a probabilidade de ele vir a ser testado in vivo será
muito baixa. Esses testes são baseados em medidas de viabilidade celular, realizada em modelos de células de fibroblastos. Uma das linhagens mais utilizadas é a BALB/c 3T3 clone 31, recomendada pelo Instituto Nacional de Saúde dos EUA
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para essa finalidade127. A linhagem BALB/c 3T3 (comumente conhecida apenas como BALB/c) é uma linhagem de fibroblastos isolados de embriões (com até 17 dias gestacionais) de camundongos albinos da raça BALB/c (Mus musculus). É uma
linhagem de fácil manuseio que sempre cresce rapidamente em monocamadas. É capaz de se dividir infinitamente, porém quando atingem 100% de confluência, ocupando toda a superfície do frasco de cultura, a divisão é interrompida128 (FIGURA 1.13).
Nesses 3 ensaios, as células são incubadas com o extrato diluído em meio de cultura por um determinado período de tempo. A quantificação do crescimento ou da viabilidade celular é expressa pelo número de células vivas na cultura, por isso ela requer então um método analítico. Para se quantificar o número de células vivas em uma cultura, existem diferentes métodos, como os de contagem direta dos núcleos celulares marcados123 ou ainda os métodos colorimétricos envolvendo a incorporação de vermelho neutro129 ou a redução de um sal tetrazólio130. O sal de tetrazólio em solução apresenta uma cor amarela e ao ser reduzido, leva à formação do formazan, que é insolúvel em água e apresenta coloração azul/violeta (FIGURA 1.14).
FIGURA 1.14 - Reação de redução do sal de tetrazólio com produção de formazan
Como possuem uma carga positiva, os íons tetrazólio são transportados para o citoplasma via diferença de potencial da membrana plasmática e tendem a interagir em regiões aniônicas, principalmente grupos fosfato ligados ao retículo endoplasmático131. Essa mesma organela produz o NADH, que, ao ser oxidado a NAD, leva à redução do sal de tetrazólio à formazan, cujos (micro)cristais são armazenados em vesículas lipídicas ou eliminados por exocitose para o meio extracelular (FIGURA 1.15A).
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FIGURA 1.15 - Cristais de formazan: (A) eliminados para o meio celular e (B) solubilizados após a adição de um agente solubilizante
O brometo de 3-(4,5-dimetilltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazólio, também conhecido como Metil-Tiazolil-Tetrazólio (MTT) é o sal de tetrazólio mais comumente utilizado nos métodos colorimétricos para estudos de viabilidade132 ou proliferação celular130 e também foi o escolhido para os estudos deste trabalho. No entanto, outros sais, como o XTT (brometo de 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H- tetrazólio-5-carboxanilida) e o NBT (brometo de nitroazul de tetrazólio) também são utilizados nesses tipos de ensaio (FIGURA 1.16)133.
FIGURA 1.16 - Estruturas químicas dos sais de tetrazólio utilizados nas análises colorimétricas dos ensaios de estrogenicidade, citotoxicidade e seletividade
Como os cristais de formazan formados são armazenados em vesículas lipídicas no citoplasma da célula, é necessário adicionar um agente solubilizante constituído por um tensoativo (geralmente dodecilsulfato de sódio, SDS; e um solvente orgânico – dimetilsulfóxido - DMSO) para romper a membrana celular e solubilizar os cristais134. Quando a solução está homogênea e translúcida, é feita uma análise colorimétrica na região do visível (FIGURA 1.15B).
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