Gjenspeilingen av sentrale prinsipper i «fragmenterte grupper» i Forsvaret

A atividade estrogênica dos extratos foi determinada por meio da proliferação celular induzida por compostos bioativos presentes nos mesmos que mimetizassem a ação do 17--estradiol, em uma adaptação do E-SCREEN (teste desenvolvido inicialmente por Soto e colaboradores)123. Antes do teste com os extratos, alguns parâmetros foram ajustados para que esse ensaio pudesse ser executado adequadamente nas condições de trabalho, conforme a sequência apresentada na FIGURA 3.5. células MCF-7 1.105 células.mL-1 ag. solublizante 100 mg.mL-1 análise 570 nm MTT 1,0 mg.mL-1 de meio DMEM MTT 5 mg.mL-1 em PBS esterilização diluição 5 x meio DMEM 24 h 37oC, 5% CO₂ 0,5; 1; 2 ; 3; 4 ou 5 h 37oC, 5% CO2 1 h temp. ambiente agitação SDS 10,0 g DMSO 100,0 mL H3CCOOH 600 L agitação

60

FIGURA 3.5 - Sequência de otimização das condições experimentais para a realização do teste de estrogenicidade

No meio de cultura DMEM há alguns potenciais interferentes que poderiam interagir no receptor estrógeno estimulando o crescimento celular: o indicador vermelho fenol e os hormônios endógenos presentes no FBS. Para verificar a interferência do indicador vermelho fenol na proliferação das células de MCF-7, o meio DMEM foi preparado sem a adição do mesmo. Os hormônios endógenos foram removidos do FBS antes que o mesmo fosse adicionado ao meio de cultura.

Comercialmente, é possível encontrar no mercado o FBS já tratado, porém com um custo bastante elevado. Alternativamente, existem alguns procedimentos descritos na literatura que possibilitam fazer essa remoção no próprio laboratório, com elevada eficiência. Nesse trabalho foram testados dois desses procedimentos. O primeiro foi adaptado daquele descrito por Yohay e colaboradores182 e consistiu em adicionar um volume de 200,0 mL de solução tampão Tris 100mM, em pH 8,00 (≥99,9%, Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil) a uma mistura de 0,5000 g de carvão ativo (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil) e 0,0500 g de dextran T-70 (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil). A suspensão ficou em agitação a 4oC por aproximadamente 10 horas, sendo, em seguida, centrifugada a 400 xg por 15 min. O sobrenadante foi descartado e ao resíduo foram adicionados 50,0 mL de FBS inativado por calor. O sistema foi incubado por 45 min a 45oC, e posteriormente centrifugado a 1000 xg por 20 min. O sobrenadante foi coletado e centrifugado novamente por mais duas vezes. Após a última centrifugação, o FBS foi esterilizado por filtração em membrana PVDF 0,22 m (Stericup®, Merk Millipore, Darmstadt, Alemanha) e adicionado ao meio de cultura DMEM sem vermelho fenol. O segundo procedimento foi adaptado de Haynes e colaboradores183. A uma mistura contendo 0,5000 g de carvão ativo e 0,0500 g de dextran foram adicionados 50,0 mL de FBS

avaliação dos interferentes presentes no meio DMEM toxicidade do solvente orgânico EtOH concentração ótima do composto de referência E2 E-SCREEN modificado

61

inativado por calor. A suspensão foi mantida sob agitação a 4oC por 30 min, seguido de repouso a 4oC por 15min. Após esse período o sistema foi centrifugado a 2500 rpm por 15 min. O sobrenadante foi coletado e novamente centrifugado nas mesmas condições por mais duas vezes. Após a última centrifugação, o FBS foi esterilizado por filtração em membrana PVDF 0,22 m e adicionado ao meio de cultura sem vermelho fenol.

Para o ensaio de interferência foi adicionado nas placas de 96 poços um dos seguintes meios de cultura:

i. meio DMEM com vermelho e com 10% (v/v) de FBS sem tratamento. ii. meio DMEM sem vermelho fenol e com 10% (v/v) de FBS sem tratamento. iii. meio DMEM sem vermelho fenol, com 10% (v/v) de FBS tratado vendido

comercialmente (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil).

iv. meio DMEM sem vermelho fenol, com 10% (v/v) de FBS tratado de acordo com Yohay.

v. meio DMEM sem vermelho fenol, com 10% (v/v) de FBS tratado de acordo com Haynes.

As células foram incubadas a 37oC, em atmosfera com 5% de CO2 por

um período de 1 a 7 dias, com troca de meio a cada 48 h de incubação. A cada 24 h de incubação era realizada uma análise com MTT, conforme descrito na seção 3.2.2. Sete replicatas foram realizadas em cada ensaio em dois experimentos independentes (n=14).Para diferenciar o FBS tratado do FBS não tratado, o primeiro será identificado no decorrer do texto como FBS-CS (do inglês charcoal stripped).

Como os extratos foram solubilizados em solvente orgânico, também foi realizado um estudo com etanol nas mesmas concentrações testadas nos extratos para verificar se o solvente poderia levar à morte das células por toxicidade. Nos poços com células aderidas, foi adicionado então o meio DMEM sem vermelho fenol, suplementado com 10% de FBS-CS, contendo etanol (o mesmo utilizado na preparação dos extratos) nas concentrações de 0,25; 0,50; 0,75; 1,0 ou 2,0% (v/v). No controle negativo do experimento, foi adicionado o meio de cultura sem solvente orgânico. As células foram incubadas por um período de 6 dias, ocorrendo a troca de meio a cada 48 h.

O último parâmetro a ser ajustado foi a concentração do composto de referência que seria utilizado como controle positivo em todos os demais estudos. Uma solução estoque de 17-β-estradiol (E2, ≥98%, Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil)

62

foi preparada na concentração de 1mmol.L-1 em etanol, esterilizada por filtração em membrana de PVDF 0,22 m e mantida a -20o

C até o momento de uso. Soluções de trabalho foram preparadas por diluição da solução estoque nas concentrações de 0,1 nmol.L-1 a 100 mol.L-1 em etanol estéril. Todas as soluções foram diluídas 100 vezes em meio de cultura para que a concentração de solvente no experimento permanecesse em 1% (v/v). Após a lavagem das células plaqueadas com PBS, foi adicionado o meio DMEM sem indicador vermelho fenol, suplementado com 10% de FBS-CS, contendo E2 nas concentrações de 1,00 pmol.L-1, 10,0 pmol.L-1, 100

pmol.L-1, 1,00 nmol.L-1, 10,0 nmol.L-1, 100 nmol.L-1 e 1,00 mol.L-1. Às células do controle negativo foi adicionado o meio de cultura contendo apenas EtOH na concentração de 1% (v/v). As células foram incubadas pro um período de até 8 dias, com troca de meio a cada 48 h.

Após o ajuste das condições, foram testados os extratos preparados conforme descrito na seção 3.1.2. Os extratos secos foram ressolubilizados nos respectivos solventes extratores para a concentração de 50 mg.mL-1, compondo as soluções estoque, que foram armazenadas a -20oC até a utilização nos experimentos de atividade biológica e caracterização química.

Nos ensaios de atividade estrogênica, para que os extratos pudessem ser administrados às células, os mesmos foram diluídos em meio de cultura. As soluções estoque foram diluídas 200 vezes em meio DMEM sem vermelho fenol, com 10% FBS-CS, de forma que a concentração final fosse 250 g.mL-1, com concentração máxima de etanol no meio de cultura igual a 0,38% (v/v) para os extratos da etapa de triagem de variáveis; e 0,5% (v/v) para os extratos da etapa de modelagem da superfície de respostas. Após a diluição, o meio com o extrato foi esterilizado por filtração em membrana de PVDF 0,22 m. Para o controle positivo, a solução estoque de E2 (1 mmol.L-1 em etanol) foi diluída em meio DMEM sem

vermelho fenol com 10% FBS-CS, para atingir a concentração final de 10 nmol.L-1,

com 1% EtOH (v/v). Para o controle negativo, o etanol esterilizado por filtração em membrana de PVDF 0,22 m foi diluído no mesmo meio de cultura para uma concentração final de 1% (v/v).

O ensaio de estrogenicidade foi realizado conforme ilustrado no fluxograma da FIGURA 3.6. As amostras diluídas de extrato, composto de referência e EtOH foram adicionadas em cada poço em soluções de 100 µL de DMEM sem vermelho fenol e suplementado com FBS-CS (10%). O meio de cultura foi trocado a

63

cada dois dias com a reposição dos extratos/E2/solvente na mesma concentração

inicial até atingir o período de incubação de seis dias. Os ensaios foram realizados em quadruplicata, em 2 experimentos independentes (n=8). Para os extratos preparados na etapa de modelagem da superfície de respostas foi realizado ainda um segundo estudo ao longo de 7 dias, nas mesmas condições.

Os extratos obtidos com o solvente extrator contendo 75, 85 e 95% EtOH foram utilizados em um estudo de inibição do crescimento celular da MCF-7. As respectivas soluções estoque foram diluídas em meio de cultura para as concentrações finais de 0,100; 1,00; 5,00; 10,0; 25,0; 50,0; 100; 250 g.mL-1, sendo imediatamente esterilizadas por filtração em membrana PVDF 0,22 m. Em cada poço com células aderidas foram adicionados 100 L do meio DMEM sem vermelho- fenol, com 10% FBS-CS, contendo os extratos ou E2 na concentração de 10 nM ou

etanol na concentração de 1% (v/v). O tempo de incubação foi de 6 dias e o meio de cultura foi trocado a cada 48 h com a reposição dos extratos/E2/solvente na mesma

concentração inicial. Para cada concentração de cada extrato foram realizadas quadruplicatas, em 2 experimentos independentes (n=8).

FIGURA 3.6 - fluxograma para o ensaio de estrogenicidade células MCF-7 em DMEM com vermelho fenol

5.104 células.mL-1 em placas 96 poços

24 h 37oC, 5% CO 2 MTT 1 mg.mL-1 troca de meio 48 h remoção do meio DMEM com

vermelho fenol lavagem com PBS

extratos 250 g.mL-1

, E2 10 nmol.L-1, EtOH 1% meio DMEM com 10% FBS-CS, sem vermelho fenol

6 d 37oC, 5% CO₂ 3 h 37oC, 5% CO₂ ag. solubilizante 100 mg.mL-1 análise 570 nm 1 h temp. ambiente agitação

64