Sølyst og Gressholmen (Hviddingsø)

sistema de regeneração previamente estabelecido, para a regeneração adventícia de meristemas (Capítulo 2). Os explantes utilizados na transformação foram entrenós de lúpulo, provenientes de plântulas micropropagadas a partir de meristemas axilares e apicais de plantas adultas (ver Capitulo 2, Fig. 2.1.)

Com o objectivo de testar a metodologia de transformação e a construção usada, foram feitos ensaios de transformação em folhas de Nicotiana tabacum. As folhas foram removidas de culturas in vitro estabelecidas, utilizando sementes cedidas pela Dr.ª Ana Lúcia Sintra da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro. Estas plantas foram subcultivadas de 3 em 3 semanas para meio fresco MS/2 (meio MS reduzido a metade nas concentrações de macro e micronutrientes), 20g/L de sacarose, pH 5,7, 8g/L de agar (V-Reis, Lisboa, Portugal), sem fitorreguladores e sem alteração da concentração de vitaminas. As culturas foram mantidas a 24±2ºC sob um fotoperíodo de 16h luz/8h escuro, obtido com lâmpadas “day-light” 35µEm-2_s-1_.

Tratamento Tipo de meio pH

Sem Antivírus Sólido 6,0

Líquido 5,5

Antivírus autoclavado Sólido 4,5

Líquido 5,0

Antivírus filtrado Sólido 5,0

3.2.3.2. Estirpes utilizadas e plasmídios

As estirpes de Agrobacterium utilizadas foram LBA 4404 (Hoekema et al., 1983) com o plasmídio p35SGUSINT (Vancanneyt et al., 1990) (Fig. 3.1) e o plasmídio pROK ArMV (Gölles et al., 1997); as estirpes EHA 105 (Hood et al., 1993) e C1C58 com o plasmídio p35SGUSINT. O plasmídio p35SGUSINT contém um intrão no gene repórter

uid A, que codifica para a β-glucuronidase (GUS) no Agrobacterium. Todos os plasmídios

contêm o mesmo gene marcador selectivo npt II, que codifica para a neomicina fosfotransferase (NPT II).

B (pROKArMV)

Figura 3.1: Plasmídios utilizados na transformação de Humulus lupulus L. npt II, região que codifica o gene da neomicina fosfotransferase; uid A, região que codifica o gene da β- glucuronidase; PIV2, intrão vegetal; cpArMV região que codifica para o gene da cápside viral do Vírus do Mosaico de Arabis; nos-Pro, promotor do gene da nopalina sintetase; nos-ter, sequência do terminador do gene da nopalina sintetase; 35S-Pro, promotor 35S do Vírus do Mosaico da Couve-flor; CaMV pA, sinal de poliadenilação do Vírus do Mosaico da Couve-flor; RB “border” direito do T-DNA; LB “border” esquerdo do T-DNA.

3.2.3.3. Sensibilidade a antibióticos

Os explantes (entrenós de plantas de lúpulo) foram colocados em meio de regeneração fresco (Capítulo 2) com cefotaxima e/ou carbenicilina. As concentrações de antibióticos testadas foram as seguintes: Cefotaxima 250mg/L (cef), Carbenicilina 250mg/L (carb) e conjugações dos dois antibióticos (cef. 250 + carb. 200mg/L; cef. 250 + carb. 250mg/L; cef. 300 + carb. 250mg/L; cef. 350 + carb. 250mg/L; cef. 200+ carb. 250mg/L). Os resultados foram observados em termos de regeneração obtida após 21 dias, nos meios suplementados com antibióticos. Mediante os resultados obtidos nos

nos-Pro npt II nos-ter 35S-Pro cpArMV nos-ter Sma I

IIIIiIIIIII

Eco RI Sma I

carb. nos ensaios de Agrobacterium tumefaciens, com o objectivo de eliminar as bactérias após o período de co-cultura planta - bactérias. Os explantes foram transferidos para meio de regeneração fresco, com carb. e cef., sem qualquer pressão selectiva (adição de canamicina), ou com a selecção aplicada aos 0, 3, 8, 14 e 21 dias, após o período de co-cultura. A concentração de can. foi testada em explantes transformados e em explantes não transformados, nas concentrações de 0,6, 12,5, 25, 50, 75mg/mL.

Os resultados obtidos foram analisados por análise de variância (ANOVA) a um factor e para comparações múltiplas de médias utilizou-se o teste Tukey HSD de comparações múltiplas (SYSTAT versão 5.0).

3.2.3.4. Transformação mediada por Agrobacterium

Nos ensaios iniciais, para a determinação da expressão transiente e modelação do processo de transformação utilizando Agrobacterium tumefaciens, seleccionou-se a estirpe LBA 4404 com o plasmídio p35SGUSINT.

O processo de co-cultura iniciou-se pela preparação da suspensão de bactérias, obtida pela colocação em 20mL de meio LB de uma colónia da estirpe LBA 4404, isolada em meio sólido. O meio de cultura utilizado para a multiplicação das bactérias (LB), é composto por: 5g/L de extracto de levedura, 10g/L de triptona, 10g/L de cloreto de sódio e 15g/L de agar (V-Reis, Lisboa), pH 7,2. Colocou-se no meio de cultura 50mg/L dos antibióticos canamicina e rifampicina para a selecção, em meio líquido, das bactérias LBA 4404, EHA 105 e C1C58 com o plasmídio p35SGUSINT. Para as bactérias LBA 4404 e C1C58 com o plasmídio pROKArMV, usou-se 100mg/L de estreptomicina e 50mg/L de can.. A suspensão de bactérias cresceu com agitação de 120 rpm, a 28ºC durante a noite. As culturas de bactérias foram utilizadas quando o seu crescimento se encontrava em fase exponencial (Absorvência 600nm= 0,6 – 0,8). Após a medição da Absorvência, a cultura foi diluída 1:50 (v/v) numa solução de sacarose 0.3% (Laimer da Câmara Machado et al., 1992). Inicialmente, foi testada a utilização do composto fenólico acetosseringona na co-cultura das bactérias C1C58 com os explantes vegetais. A acetosseringona foi testada em ensaios de transformação, na concentração de 20μm, sendo a expressão transiente do gene uid A dos explantes resultantes desses ensaios, comparada com a expressão do mesmo gene em ensaios de transformação, onde não foi adicionada acetosseringona.

Nos ensaios de transformação com pré-cultura, o material vegetal foi previamente cortado 26h ou 48h antes e colocado a incubar a 22 ± 2ºC no escuro, em meio de regeneração.

Nos ensaios com imersão, o material foi mergulhado numa solução de sacarose 0,3% e bactérias (OD=0,6), sendo a solução diluída para um valor final de 0,2. Nestes ensaios, utilizaram-se explantes provenientes de entrenós. Após a imersão, cuja duração variou entre 10 e 12 minutos, os entrenós foram secos em papel de filtro estéril e colocados em meio fresco de regeneração com antibióticos. Em simultâneo, foi testada a utilização da cultura bacteriana, na transformação, sem diluição em solução de sacarose.

3.2.3.5. Selecção do material após transformação

Após 48 a 72 horas de co-cultura, os explantes foram transferidos para meio de cultura idêntico ao utilizado durante a co-cultura, ao qual foi adicionado 250mg/L de carb e 250mg/L de cef. Parte do material foi transferido para meio com 25mg/L de canamicina (can.), para além dos antibióticos de eliminação das bactérias. Três semanas depois, o material foi novamente transferido para meio de selecção suplementado com 50mg/L de can. Os meristemas regenerados foram transferidos para meio de micropropagação contendo antibióticos de selecção (50mg/L de can). Depois desta sub-cultura o material foi seguido semanalmente, até a transferência seguinte, para meio fresco, que ocorreu após 6 semanas.

Os resultados foram analisados estatisticamente utilizando o teste de análise de variância, ANOVA a um factor.