Kvinner som byggmesterinner

A determinação de infecções virais nas plantas que serviram de base a todo o trabalho posterior de transformação, revelaram que, de um modo geral, as plantas apresentavam um estado fitossanitário satisfatório. Os valores obtidos no caso das plantas de Br demonstraram infecção com o vírus PNRSV em apenas um quinto do “stock” de plantas, o que permitiu a utilização das restantes 80% como material de partida para a transformação. O processo de determinação por DAS-ELISA, das infecções virais, mostrou ser uma ferramenta apropriada, embora existam registos de alguns vírus que permanecem nas plantas in vitro em títulos suficientemente baixos, pelo que não são detectados com este método (Knapp et al., 1995). No entanto, o leque de vírus analisado pareceu-nos suficientemente alargado e os valores de DAS-ELISA suficientemente baixos (nos 80% não infectados), para nos permitirem a utilização das plantas “stock” em transformação com segurança. Actualmente é possível utilizar outros métodos de detecção como RT-PCR (reverse transcriptase PCR), PCR-imunocaptura, cromatografia líquida e PCR em tempo real (Eun et al., 2000; Beuret, 2004). Embora estes sejam métodos mais sensíveis e nalguns casos capazes de determinar e quantificar vírus, são métodos excessivamente dispendiosos. Outros trabalhos utilizaram igualmente com sucesso DAS-ELISA de rotina, na determinação das infecções virais (Abbott et al., 1993; Spielmann et al., 2000; Pang et al., 2000; Johansen et al., 2001; Wang et al., 2001; François et al., 2002).

3.4.2. Termoterapia

O método de aplicação de temperaturas elevadas (entre 30 e 36ºC) às plantas in

vitro, para eliminação de viroses, já é utilizado desde os anos 50 do século XX (Posnette

& Cropley, 1956; Welsh & Nyland, 1965; Vine & Jones 1969; Adams, 1975; Probasco & Winslow, 1986) quer utilizando só a temperatura, quer associando-a ao isolamento dos meristemas apicais. A eliminação dos vírus depende, não só do vírus em causa, como das próprias plantas infectadas (Knapp et al., 1995). Embora ainda não seja completamente claro, pensa-se que a eliminação dos vírus estará associada tanto à inactivação das partículas virais na planta infectada, como à inactivação da própria síntese das ditas partículas, por parte do vírus, por inactivação de, entre outras, moléculas da replicase viral (Dijkstra & Jager, 1998). As infecções virais estão

dependentes de duas vertentes: a infecção célula a célula e a infecção a longa distância, e qualquer delas, dependente de uma interacção entre o vírus e o hospedeiro. As proteínas virais responsáveis pelo movimento, a longa distância e célula a célula, estão intimamente ligadas às estruturas citoplasmáticas, relações que implicam gastos de energia (Carrington et al., 1996). A temperatura mais elevada, a actividade metabólica das células hospedeiras é alterada, condicionando assim a formação e a actividade das proteínas virais responsáveis pelo movimento. A termoterapia associada ao isolamento de meristemas in vitro (Chiari & Bridgen, 2002), assegura de um modo geral, mesmo nos vírus que se sabe que conseguem invadir os meristemas apicais, a obtenção de plantas livres de vírus. Em muitos casos estes métodos são já utilizados comercialmente, para a obtenção de plantas “stock” isentas de vírus e para o intercâmbio de material vegetal a nível internacional. De entre as plantas comerciais utilizadas pode-se destacar-se o morangueiro, a batateira e várias plantas ornamentais (Dijkstra & Jager, 1998).

Da análise dos nossos resultados verificou-se a ocorrência de necrose de alguns meristemas, que nos parece estar relacionada, preponderantemente, com a manipulação dos meristemas aquando do seu isolamento. Embora a bibliografia refira, como causa de morte, a utilização de material de vidro, pela toxicidade do cobre e chumbo presente no vidro (Dijkstra & Jager, 1998), neste trabalho foi utilizado, exclusivamente, material de Pyrex , pelo que esse problema não se põe. O facto de se terem obtido plantas livres de vírus após este tratamento (os testes foram repetidos 6 meses depois, com resultados positivos), leva-nos a concluir que o processo de termoterapia e ulterior isolamento de meristemas foram eficientes para a eliminação de viroses de lúpulo, como verificado em trabalhos anteriores com esta (Adams, et al., 1975; Matousek et al., 1995) e outras espécies (Knapp et al., 1995; Dijkstra & Jager 1998). A temperatura de terapia terá sido a indicada, e o isolamento feito com meristemas suficientemente reduzidos para permitir a efectiva limpeza de vírus dos mesmos. Parâmetros fundamentais na sobrevivência do material manipulado e na efectiva eliminação dos vírus.

3.4.3. Antivírus químico

A obtenção de plantas livres de vírus após utilização do antivírus Isoprinosina, foi eficaz para os vírus testados neste trabalho, visto que se conseguiu este objectivo sem que o crescimento e normal desenvolvimento das plantas fossem comprometidos.

Os dois métodos de utilização deste composto antiviral, testados neste trabalho, mostraram que em qualquer um dos casos foi possível obter plantas isentas de vírus. Os

resultados obtidos com a utilização do antivírus filtrado foram melhores, tendo-se obtido, cerca do dobro das plantas, comparativamente com a utilização do antivírus autoclavado. Atendendo à maior percentagem de morte no material vegetal e ao número inferior de plantas isentas de vírus obtidas no tratamento com antivírus autoclavado, comparativamente com os resultados obtidos com a utilização de antivírus filtrado, podemos considerar que durante a autoclavagem houve alteração do meio. Assim, várias hipóteses se põem: (1) A alteração seria de parte das moléculas do composto, podendo essa alteração ser de algum modo tóxica para as plantas e limitaria o grau de eficiência antivírica do composto. (2) Não há toxicidade do composto apesar da alteração do pH comprometer a capacidade antivírica do mesmo. (3) A alteração do meio, mais liquefeito e com maior acidificação, poderá ser a causa destes resultados. Visto que a acidificação poderá alterar a tomada dos minerais do meio, e a anóxia associada à maior liquidez do meio, compromete a respiração e consequentemente sobrevivência das plantas. Para testar estas hipóteses teriam que ser feitos mais ensaios com antivírus autoclavado, a pH superior, de molde a controlar a acidez e liquidez do meio, para que esses parâmetros sejam desprezáveis em futuros testes com antivírus autoclavado.

O modo como este composto actua na planta deverá ser objecto de estudo ulterior. Na bibliografia disponível, não se encontram referências à utilização deste tipo de compostos, como meio de tratamento de plantas. O antivírus utilizado é prescrito para o combate a vírus animais e, embora existam diferenças nos processos de infecção entre vírus animais e vegetais, alguns passos e características são semelhantes, razão pela qual decidimos testá-lo. A diferença mais importante será talvez o modo de dispersão pelo hospedeiro. Os vírus vegetais têm de ultrapassar uma barreira extra, a parede celular das células que infectam. Dado que este composto revelou alguma eficácia no controlo da infecção viral, e sendo originalmente aplicado a vírus animais, sugere que, o seu modo de acção não estará relacionado com um efeito na mobilidade do vírus, mas sim na sua própria expressão, como agente infeccioso.

3.4.4. Transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens