4.1. Investigação da ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na Lagoa do Gambá, Ouro Preto, MG
Coleta da amostra
Em julho de 2007, foi coletada uma amostra de cinco litros de água da Lagoa do Gambá (Figura 4.1). A água contendo aglomerados algais foi acondicionada em um recipiente plástico, preservada em gelo a aproximadamente 4ºC (COPASA-MG, 1992) e encaminhada para exame imediato no setor de hidrobiologia do Laboratório Central da COPASA.
Figura 4.1: Lagoa do Gambá, Ouro Preto, MG.
Análise qualitativa do fitoplâncton
Para a análise qualitativa, foi utilizado um microscópio binocular da marca LEITZ, modelo Laborlux. Pequenas alíquotas de amostras in vivo foram depositadas em lâminas de vidro e cobertas com tinta nanquim, para favorecer a visualização melhor da bainha de mucilagem e das colônias de cianobactérias, em aumento de 40 vezes. As lâminas foram cobertas com lamínulas e observadas em aumentos maiores (400 e 1000 vezes), para facilitar a visualização e aumentar a precisão da medida das células. Para o aumento de 1000 vezes utilizou-se sempre
óleo de imersão. O sistema de classificação adotado para gêneros foi de Bourrely (1985, 1972, 1968).
Concentração da amostra
A concentração da amostra foi baseada na metodologia adotada em Jardim et al. (1999). A amostra foi transferida para três balões de decantação com capacidade de dois litros cada. Após 24 horas em repouso, desprezou-se a água do fundo dos balões e o volume do concentrado decantado foi medido, totalizando 100mL. O volume total foi dividido e transferido para três placas de Petri previamente pesadas. As placas foram tampadas, levadas ao freezer à -20ºC onde permaneceram durante 24 horas. O concentrado algal congelado foi liofilizado em um liofilizador de bancada da marca MicroModulyo durante 48 horas e em seguida, as placas de Petri foram retiradas e pesadas novamente para o cálculo da concentração em mg.L-1.
Extração, purificação e análise de microcistinas
Para a extração das microcistinas foi adicionada uma solução de metanol 75% às placas de Petri contendo o extrato de células liofilizadas, segundo a metodologia descrita em Fastner et
al. (1998) e apresentada na Figura 4.2.
A solução do extrato de células foi recolhida em um béquer de 250mL, deixada sob agitação e evaporação em capela (45ºC) até atingir a terça parte do volume inicial para a concentração das microcistinas. O material foi centrifugado três vezes a 2200G.s-1 e o sobrenadante foi recolhido. Na seqüência, a purificação do concentrado foi realizada de acordo com o método proposto em Krishnamurth et al. (1986). O concentrado foi purificado em cartucho SPE de octadecilsilano (ODS-C18) (capacidade para dez mL de volume) previamente ativado com dois volumes de metanol a 100% e dois volumes de água Milli-Q (Figura 4.3). Após a passagem da amostra, em um sistema a vácuo, o cartucho foi lavado com dois volumes de água Milli-Q e dois volumes de metanol 20%. Em seguida, a toxina foi eluída do cartucho com dois volumes de metanol 75% (com 0,1% de ácido trifluoracético – TFA) e esta fração foi recolhida em um tudo de ensaio e deixada em banho-maria a aproximadamente 45ºC (nitrogênio gasoso).
Figura 4.3: Purificação de toxina em cartucho SPE de octadecilsilano (ODS-C18) em câmara de filtração a
Para a análise de microcistinas, a amostra foi ressuspensa em seis mililitros de água Milli-Q e filtrada em filtro seringa com membrana de ester de celulose com poros de 0,45µm. A análise foi realizada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), um equipamento da marca HP, modelo 1100, com um detector de ultravioleta (UV) para a determinação da absorbância no comprimento de onda de 238nm. Um gradiente de acetonitrila e acetato de amônio na proporção 28/72 (v/v) e na concentração de 20mmol.L-1, em pH 5, foi utilizado com o fluxo de 2mL.min-1 em coluna Macherey-Nagel (ODS-C18), de dimensões 150x4,6mm. O tempo de retenção do espectro de absorção na região do UV do material analisado foi comparado com o correspondente ao padrão de microcistina-LR utilizado (Microcystis RST 9501).
Para a quantificação da microcistina extraída foi também utilizado um kit imunoenzimático do tipo ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) (Figura 4.4), proposto por Chu et al. (1990), que é oferecido comercialmente (Beacon, CPP-023).
Figura 4.4: Kit imunoenzimático ELISA para a quantificação de microcistinas.
Os resultados da investigação da ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na Lagoa do Gambá serão apresentados no tópico 5- Resultados e Discussão a seguir neste trabalho. A ausência de toxicidade da amostra foi um fator limitante para a realização dos ensaios de adsorção de toxinas em carvões ativados, incluídos nos objetivos propostos para este trabalho. Este resultado conduziu à necessidade do cultivo de uma espécie tóxica, Microcystis protocystis,
cedida pelo setor de hidrobiologia do Laboratório Central da Companhia de Saneamento de Minas Gerais (COPASA).
4.2. Avaliação da capacidade de adsorção de carvões em pó ativados para remoção de cianotoxinas em águas contaminadas
4.2.1. Microcistina-RR – adsorbato
Cultivo celular da espécie Microcystis protocystis (cepa HBRF01)
Para a realização dos experimentos de adsorção, um extrato bruto contendo microcistina- RR foi preparado a partir do cultivo monoespecífico da cepa tóxica da espécie Microcystis
protocystis (cepa HBRF01). O inóculo foi fornecido pelo setor de hidrobiologia do Laboratório
Central da COPASA, proveniente de floração natural de cianobactérias observada no reservatório de Furnas (21º27’29,3’’S/45º59’47’’O), situado ao sul do estado de Minas Gerais.
O cultivo foi realizado em meio ASM-1 líquido conforme proposto por Gorham et al. (1964), sob aeração contínua, temperatura controlada a 22 ± 1oC e iluminação contínua de luz fria fluorescente com intensidade da ordem de 40µmol de fótons.m-2.s-1. O meio de cultura foi preparado a partir de 977,5mL de água deionizada, adicionando-se os sais nutrientes necessários para estimular o crescimento de microalgas (Anexo II), seguindo a proporção de 20mL da solução-estoque A, 2mL da solução-estoque B, 0,1mL da solução-estoque C e 0,4mL da solução- estoque D. O pH do meio foi mantido entre 7,0-8,0, corrigido eventualmente com solução 1M NaOH.
A espécie M. protocystis foi cultivada em um frasco Mariotte de nove litros de volume, sob as condições descritas acima durante oito semanas. O crescimento algáceo foi acompanhado semanalmente através de contagem celular ao microscópio em uma câmara de Sedgwick-Rafter (APHA, 2005) (Figura 4.5).
Figura 4.5: Cultivo da espécie Microcystis protocystis.
Extração, purificação e análise de Microcistina-RR
O volume total (9L) da cultura de M. protocystis foi dividido em partes iguais em frascos previamente pesados e levado ao freezer à -20ºC. A extração e a purificação do material foram realizadas seguindo a mesma metodologia descrita anteriormente no tópico 3.1- Investigação da ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na Lagoa do Gambá.
Para a primeira determinação da quantificação de toxinas purificadas foi utilizado o kit imunoenzimático do tipo ELISA da marca EnviroLogic. Posteriormente, a análise foi realizada por CLAE. A comparação dos resultados do kit ELISA em relação àqueles obtidos na análise utilizando CLAE mostrou grande diferença na determinação da concentração de toxinas. Sabe-se que existe grande possibilidade de obtenção de resultados falso-positivos pela utilização do método ELISA, isto é, os resultados podem ser positivos quando provavelmente não existe presença de toxinas na amostra (Meriluoto et al., 2006). Diante dessa possibilidade, optou-se por realizar as análises posteriores através da técnica CLAE.
Todas as amostras foram analisadas por CLAE, equipamento da marca Waters Alliance modelo 2998 equipado com detector fotodiodo (DAD) (Figura 4.6). A separação cromatográfica foi desenvolvida em coluna Merck LiChrospher 100 RP-18 (5µm). A determinação das microcistinas por CLAE-DAD foi realizada usando um gradiente de fase móvel de água Milli-Q + 1% TFA (eluente A) e acetonitrila + 1% TFA (eluente B) e detecção por fotodiodo na região do ultravioleta em comprimento de onda de 200-300nm. As condições de gradiente linear foram
estabelecidas da seguinte forma: 65% eluente A e 35% eluente B como condições iniciais. Após 5 minutos, o gradiente foi modificado para 0% eluente A e 100% eluente B. Ao término das análises, o gradiente foi reajustado para as condições iniciais. O tempo total de uma corrida foi de oito minutos, em temperatura de 40oC. O volume da amostra injetada foi de 80µL, com o fluxo de 1mL.min-1. Para a quantificação de microcistina-RR foi utilizado o padrão de microcistinas Axxora (Grünberg, Alemanha), 98% de pureza, e determinada uma curva de calibração usando as concentrações de 1, 5, 10, 50, 100µg.mL-1.
Figura 4.6: Cromatógrafo equipado com detector fotodiodo utilizado para a identificação e quantificação de
toxinas.
Os resultados das análises por CLAE serão apresentados no tópico 5- Resultados e Discussão a seguir neste trabalho. O cromatograma referente à análise da purificação de toxinas mostrou que, além do pico de microcistina-RR, outros picos não determinados estiveram presentes. Dessa forma, a amostra foi concentrada em cartuchos Waters SPE de octadecilsilano (ODS-C18), previamente ativados com 5mL de metanol grau HPLC, e eluída dos cartuchos com
o mesmo volume de metanol grau HPLC. O eluente foi completamente evaporado e a toxina foi ressuspensa em 1mL de metanol grau HPLC, gerando uma solução-estoque de concentração 1mg.mL-1 de microcistina-RR.
4.2.2. Água Milli-Q
Soluções do adsorbato em concentrações de 10µg.L-1 e 100µg.L-1 foram preparadas utilizando água Milli-Q do sistema Millipore (resistência 18,2MΩ).
4.2.3. Carvões ativados em pó (CAP) - adsorventes
Cascas de sementes de M. oleifera têm sido usadas na preparação de vários tipos de carvões que vêm sendo produzidos no laboratório de Físico-Química de Superfícies (DEQUI/ICEB/UFOP). As variações na produção envolvem diferenças na temperatura (750 – 950oC), no tempo (5 – 120 minutos) e no tipo de ativação (vapor d’água e CO2) dos mesmos. Para a avaliação da capacidade de adsorção de microcistina-RR, foram selecionados três diferentes carvões derivados das cascas das sementes de M. oleifera, originadas de Patos, Paraíba. Dois carvões foram ativados por vapor d’água à temperatura de 750oC com tempos de ativação de 10 e 30 minutos, respectivamente. O terceiro carvão selecionado foi ativado por CO2 a 950oC durante 60 minutos.
Para a comparação da eficiência de adsorção de microcistina-RR pelos carvões produzidos, foi realizado também um ensaio de adsorção de microcistina-RR com o carvão PICA G210 AS disponível comercialmente (PICA, França). Segundo as especificações do fabricante, PICA G210 AS é derivado de cascas de coco.
Produção dos carvões ativados em pó (CAP)
A produção dos carvões ativados foi realizada incluindo pirólise ou carbonização e a ativação física das cascas das sementes.
A carbonização consiste no tratamento térmico (pirólise) da matéria-prima precursora em atmosfera inerte de nitrogênio (N2). Esta etapa constitui uma fase de preparação do material na qual os componentes voláteis e gases leves são removidos, produzindo uma massa de carbono fixo e uma estrutura porosa primária que favorece a ativação posterior. A ativação consiste em submeter o material carbonizado a reações secundárias, visando o aumento da área superficial relativa e a porosidade do carvão.
Na etapa da pirólise, as cascas das sementes de M. oleifera foram primeiramente trituradas em um liquidificador. Em seguida, 20g de cascas trituradas (massa inicial, Minicial) foram colocadas em um reator de aço inoxidável e inseridas na mufla (Fornos Lavoisier modelo 4008) com controle digital de temperatura (THOLZ) (Figura 4.7). O reator, concebido pela equipe do laboratório, é composto por um cilindro de aço inoxidável AISI 309, com tampa rosqueada, no qual foram adaptados dois tubos para entrada e exaustão dos gases. O material foi aquecido até a temperatura de pirólise pré-estabelecida e mantido nesta temperatura por um intervalo de tempo pré-determinado. O fluxo de N2 utilizado no processo de carbonização foi determinado com o auxílio de uma bureta contendo água com detergente e um cronômetro. Este método consiste no acompanhamento do deslocamento da bolha (mL) por unidade de tempo (s).
Após a pirólise, na etapa da ativação por CO2 o termostato foi regulado para o aquecimento até a temperatura de ativação de 950oC pré-estabelecida, que foi mantida durante um intervalo de 60 minutos. O fluxo do gás ativante foi determinado com o auxílio do dispositivo acima descrito. Decorrido o tempo de ativação, a mufla foi desligada e o carvão permaneceu no interior do reator até que sua temperatura retornasse à temperatura ambiente. Na seqüência, o carvão foi removido do reator e direcionado para o dessecador. A massa final de carvão produzido (Mfinal) foi pesada para o cálculo do burn-off (BO) e por último, as cinzas do carvão foram removidas com 30mL de solução de HCl 0,2 molar. O carvão foi filtrado, lavado com água destilada e colocado na estufa de secagem.
Cálculo do burn-off - x100 M M M BO inicial final inicial − =
Após a pirólise, na etapa da ativação por vapor d’água, o termostato foi regulado para o aquecimento até a obtenção da temperatura de ativação de 750oC pré-estabelecida. Para a
produção do primeiro carvão ativado por vapor d’água, o tempo de ativação utilizado foi de 10 minutos. Para a produção do segundo carvão ativado por vapor d’água, o tempo de ativação utilizado foi de 30 minutos. O fluxo do gás ativante foi determinado com o auxílio de uma bureta, contendo água com detergente e um cronômetro. Decorrido o tempo de ativação, a mufla foi desligada e o carvão permaneceu no interior do reator até que sua temperatura retornasse à temperatura ambiente. Na seqüência, o carvão foi removido do reator e direcionado para o dessecador. A massa final de carvão produzido (Mfinal) foi pesada para o cálculo do burn-off (BO) e por último, as cinzas foram removidas com 30mL de solução de HCl 0,2 molar. O carvão foi filtrado, lavado com água destilada e colocado na estufa de secagem.
A figura 4.7 ilustra a produção de carvões no laboratório de Físico-Química de Superfícies (DEQUI/ICEB/UFOP).
Figura 4.7: (A) Produção de carvões ativados derivados das cascas das sementes de Moringa oleifera; (B) Reator de
aço inoxidável e mufla utilizados para a carbonização e ativação das cascas das sementes de Moringa oleifera. A
Caracterização dos carvões ativados em pó (CAP)
Os carvões produzidos em laboratório foram encaminhados para a análise das características superficiais (área superficial e porosidade) através da metodologia BET (DEMET/EM/UFOP).
Área superficial específica (BET)
A adsorção de gases apresenta-se como uma técnica utilizada para caracterizar os principais parâmetros de porosidade de um sólido, que são a área superficial e a distribuição de tamanho de poros (Teixeira et al., 2001).
O método consiste em fazer a amostra sólida adsorver um gás (N2, Ar, Kr, CO2) após sua degaseificação forçada. No caso da utilização do N2, a amostra pesada é colocada em uma ampola, dentro de um frasco de Dewar repleto de nitrogênio líquido a 77K, de forma que o gás penetre na mesma. Após a obtenção do equilíbrio, mede-se a pressão residual do gás. Conhecendo-se a pressão gasosa inicial é possível deduzir a quantidade adsorvida. Constrói-se em seguida a isoterma de adsorção do nitrogênio. A aplicação da teoria BET (Brunauer, Emmet e Teller) permite o cálculo da superfície específica, pela expressão:
s m m A M m VM A V N S . . . =
onde, SM é a área superficial por unidade de massa (m2.g-1), NA é o número de Avogrado, Vm é o volume de gás (cm3) na monocamada, Am é a área ocupada por uma molécula de adsorbato gasoso, VM é o volume de um mol do gás e ms é a massa da amostra.
A degasagem das amostras do sólido foi realizada a 100oC, por seis horas sob pressão de 10-4mmHg e o equipamento utilizado foi um instrumento NOVA1000 da QUANTACHROME, USA (DEMET/EM/UFOP).
Análise Termogravimétrica (TGA)
Para as análises termogravimétricas, cinco gramas de cascas das sementes de M. oleifera foram pesadas e acondicionadas em uma cápsula de alumina, e analisadas em um equipamento Simultaneous DTA-TGA da TA Instruments, modelo SDT – 2960.
As análises foram realizadas sob fluxo de nitrogênio, com taxa de fluxo do gás de 100mL.min-1 e taxa de aquecimento de 10oC.min-1, sendo a faixa da temperatura varrida de 10 a 1000oC.
A análise termogravimétrica gera como resultado uma curva de decomposição térmica que fornece os percentuais dos fragmentos de massa perdidos em função da temperatura.
Fotografia em microscópio eletrônico de varredura (MEV)
O microscópio eletrônico de varredura (MEV) utilizado para análise das amostras é um equipamento da marca JEOL, modelo JSM 5510, com um sistema de captura de fotos reflex acoplado, no qual se utilizaram filmes preto e branco de 120mm.
Para análise das amostras de CAP no MEV, fez-se necessário uma preparação dos carvões, que consistia em secar o material em estufa para posterior metalização das “lâminas”. A metalização da amostra e posterior análise no MEV foi executada pela equipe de técnicos do Laboratório MicroLab (DEGEO/EM/UFOP).
As amostras foram montadas sobre suportes metálicos específicos, denominados stubs, que permitem a fixação das mesmas dentro do MEV para observação. No processo de metalização, as amostras foram cobertas com uma fina camada de ouro particulado, utilizando um Sputter Coater, modelo JEOL JEE 4C Evaporator.
Após o processo de metalização das amostras, essas foram encaminhadas para análise no MEV, onde foram fotografadas em diferentes níveis de aumento.
Medida do Potencial Zeta (PZ)
Quase todos os materiais macroscópicos ou particulados em contato com um líquido adquirem uma carga elétrica em sua superfície. Essa carga pode aparecer de várias maneiras - a dissociação de grupos ionogênicos na superfície da partícula e a adsorção diferencial de íons da solução na superfície da partícula. A carga líquida na superfície da partícula afeta a distribuição de íons na sua vizinhança, aumentando a concentração de contraíons junto à superfície. Assim, forma-se uma dupla camada elétrica na interface da partícula com o líquido (Atkins et al., 2002).
Essa dupla camada divide-se em duas regiões: uma região interna que inclui íons fortemente ligados à superfície e uma região exterior onde a distribuição dos íons é determinada pelo equilíbrio entre forças eletrostáticas e movimento térmico. Dessa forma, o potencial nessa região decai com o aumento da distância da superfície até, a uma distância suficientemente grande, atingir o potencial da solução. Esse potencial é convencionado como potencial zero (Atkins et al., 2002).
Em um campo elétrico, como em microeletroforese, cada partícula e os íons mais fortemente ligados à mesma e algumas moléculas do solvente se movem como uma unidade, e o potencial no plano de cizalhamento entre essa unidade e o meio circundante é chamado potencial zeta (Atkins et al., 2002).
Quando uma camada de macromoléculas é adsorvida na superfície da partícula, ela move o plano de cizalhamento para longe da superfície e altera o potencial zeta. Dessa forma, o potencial zeta é função da carga superficial da partícula, de qualquer camada adsorvida na interface com o meio e da natureza e composição do meio que a circunda. Esse potencial pode ser determinado experimentalmente e, como ele reflete a carga efetiva nas partículas, ele se correlaciona com a repulsão eletrostática entre elas e com a estabilidade da suspensão.
O potencial zeta não pode ser medido diretamente. Assim, usa-se algum tipo de medida indireta, a partir da qual se calcula o potencial zeta. A técnica mais usada e mais aceita é através da mobilidade eletroforética, introduz-se uma suspensão coloidal diluída em uma cuba com dois eletrodos e aplica-se um potencial elétrico à suspensão. As partículas com carga elétrica líquida mover-se-ão na direção do eletrodo de carga contrária, tão mais rapidamente quanto maior a sua carga elétrica e maior o campo elétrico aplicado (Atkins et al., 2002).
O potencial zeta do carvão derivado das cascas das sementes de Moringa oleifera, ativado por CO2, foi medido pelo equipamento Malvern Instruments (zetasizer Nano 0) (DEMIN/EM/UFOP).
4.2.4. Ensaios de adsorção
Para todos os CAP, foram utilizadas soluções de adsorbato microcistina-RR (10µg.L-1 e 100µg.L-1) com tempos de contato de 30 e 60 minutos, para cada concentração. As amostras controles foram realizadas com as soluções de adsorbato (10µg.L-1 e 100µg.L-1), porém, sem a adição de CAP. A dosagem de CAP foi definida em 18mg.L-1. Cada condição experimental foi analisada em triplicata, totalizando três soluções de adsorbato com a presença de CAP e três soluções de adsorbato sem CAP, para cada concentração e tempo determinados.
Os ensaios de adsorção foram realizados à temperatura ambiente com volumes totais de mistura de 50mL, em frascos de vidro de 100mL devidamente fechados, sob mesa agitadora orbital com velocidade de rotação de 100rpm(Nova Ética) e temporizador programável por 30 e 60 minutos (Figura 4.8). Após a agitação, as misturas foram imediatamente filtradas em membrana de ésteres de celulose (Millipore) com abertura de poros de 0,45µm para a separação do material suspenso. Em seguida, as amostras (50mL) foram extraídas e pré-concentradas em cartuchos Waters SPE de octadecilsilano (ODS-C18), previamente ativados com 5mL de metanol grau HPLC. Posteriormente, as microcistinas foram eluídas dos cartuchos com 5mL de metanol grau HPLC e o eluente foi evaporado. Anteriormente às análises por CLAE, as amostras foram ressuspensas em 1mL de metanol grau HPLC e filtradas com filtro seringa com tamanho de poro de 0,45µm. O pH do meio reacional manteve-se na faixa entre 6,0 a 8,0 sem nenhuma correção do seu valor.
Figura 4.8: Ensaio de adsorção de microcistina-RR (adsorbato) nas concentrações de 10µg.L-1 e 100µg.L-1 por
carvão ativado em pó (adsorvente) na dosagem de 18mg.L-1, com tempo de contato de 30 e 60 minutos.
A Figura 4.9 sintetiza de forma esquemática os procedimentos adotados desde a extração das