O objetivo principal do estudo realizado foi o estabelecimento do perfil metabolómico volátil de amostras de saliva e de urina, com o intuito de identificar metabolitos que possam ser considerados como potencias biomarcadores em indivíduos com neoplasia da mama e do pulmão. Para tal, recorre-se à técnica HS-SPME seguida de GC-MS.
De modo a utilizar a metodologia HS-SPME no estudo dos componentes voláteis das amostras salivares efetuou-se a otimização dos parâmetros com influência na eficiência de extração, tais como o tipo de fibra, o tempo e a temperatura de extração, a força iónica, o pH, o volume e a agitação da amostra. A fibra CAR/PDMS apresentou melhor capacidade extrativa, distinguindo-se das restantes fibras testadas tanto pela área analítica atingida como pelo número de metabolitos extraídos. Quanto aos restantes parâmetros otimizados, a extração foi mais eficiente utilizando 2 mL de saliva acidificada, 10% NaCl (m/v) e 45 minutos de extração a 37±1°C. Contudo, optou-se por utilizar um volume de 1 mL de modo a ser possível efetuar as extrações em duplicado.
Depois da otimização da metodologia HS-SPME para as amostras salivares, realizou-se a análise de VOMs presentes nas amostras de saliva e de urina, utilizando a metodologia HS- SPME associada à GC-MS. No estabelecimento do perfil volátil da saliva do grupo controlo foram analisadas 16 amostras de indivíduos saudáveis, 36 amostras de indivíduos com cancro da mama e 13 de pacientes com cancro do pulmão.
A análise das amostras salivares permitiu detetar metabolitos voláteis pertencentes a diversas famílias químicas, tais como, ácidos orgânicos, alcanos, alcenos, álcoois superiores, cetonas, compostos azotados, compostos sulfurados, compostos terpénicos, derivados benzénicos, fenóis e ainda um grupo de compostos não incluídos em nenhuma destas famílias químicas. A família química mais representativa, presente nos três grupos estudados, correspondeu aos ácidos orgânicos, seguindo-se os compostos azotados. A comparação entre os grupos mostrou que estas duas famílias químicas assim como as cetonas e os fenóis apresentaram área média mais elevada no grupo de pacientes com cancro do pulmão. Por outro lado, os compostos sulfurados, os compostos terpénicos e os derivados benzénicos mostraram uma área média superior no grupo de pacientes com cancro da mama. A única família com área total mais elevada no grupo controlo foram os álcoois superiores. Os alcanos e os alcenos foram identificados apenas no grupo com neoplasia da mama. Os treze metabolitos maioritários identificados nos grupos estudados pertenciam às famílias químicas dos ácidos orgânicos, fenóis, estando ainda presentes um álcool superior e um derivado
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benzénico. Os metabolitos maioritários foram o ácido acético, o 2-etil-1-hexanol, o ácido propanoico, o ácido-2-metil-propanoico, o ácido butanoico, o ácido-3-metil-pentanoico, o ácido-4-metil-pentanoico, o 2-cloro-fenol, o 3-bromo-fenol, o fenol, o 4-metil-fenol, o p-tert- butil-fenol e por fim o ácido benzenocarboxílico. Destes metabolitos, os que apresentaram maior área total e uma diferença estaticamente mais significativa foram o ácido acético, o ácido propanoico e o ácido butanoico, sendo que estes apresentaram maior área total no grupo de pacientes com cancro do pulmão.
Quanto às amostras de urina foram analisadas 16 amostras de indivíduos sem neoplasia, 30 amostras de indivíduos com cancro da mama e 16 de pacientes com cancro do pulmão.
Através da análise das amostras urinárias foi possível identificar metabolitos voláteis de diferentes famílias químicas, tais como, ácidos orgânicos, alcenos, álcoois superiores, aldeídos, cetonas, compostos furânicos, compostos sulfurados, compostos terpénicos, derivados benzénicos, fenóis, ésteres e por fim um grupo de compostos não incluídos em nenhuma destas famílias químicas.
Os compostos sulfurados foram a família química com maior área total presente nos três grupos estudados, seguindo-se as cetonas e os compostos furânicos. Ao compararmos os grupos estudados verificou-se que para a maioria das famílias, o grupo controlo possuiu uma área total superior. No entanto, os aldeídos apresentaram uma área analítica superior no grupo com cancro da mama e os compostos sulfurados assim como os compostos furânicos foram superiores no grupo com cancro do pulmão. Para além disto, foi possível observar que os ésteres foram identificados apenas no grupo controlo e no grupo com cancro da mama. No caso dos ácidos orgânicos e dos álcoois superiores não se verificam diferenças significativas entre os grupos controlo e do cancro do pulmão.
Dos dezassete metabolitos maioritários existentes nos três grupos estudados verificou- se a presença de cinco fenóis, três compostos terpénicos, dois compostos furânicos, dois compostos sulfurados, dois derivados benzénicos, estando ainda presentes um hidrocarboneto clorado, uma cetona e um ácido orgânico. Os metabolitos maioritários foram o furano, o cloreto de metileno, o dissulfureto de dimetilo, o 4-heptanona, o p-cimeno, o o-cimeno, o trissulfureto de dimetilo, o 2-metil-5-(metiltio)-furano, o p-cimeneno, o ácido acético, o 4,7- dimetil-benzofurano, o 1,2-dihidro-1,1,6-trimetil-naftaleno, o 2-bromo-fenol, o fenol, o 4- metil-fenol, o p-tert-butil-fenol e finalmente o 2,4-bis(1,1-dimetiletil)-fenol. De todos os metabolitos maioritários os que apresentaram maior área total e uma diferença estatística mais significativa foram o furano, o dissulfureto de dimetilo e o p-tert-butilfenol. Os dois
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primeiros metabolitos apresentaram maior área total no grupo com neoplasia do pulmao, por outro lado, foi no grupo controlo que o p-tert-butilfenol apresentou maior área total.
O método PLS-DA foi realizado com o intuito de verificar a distribuição das variáveis dos grupos controlo e oncológicos e identificar metabolitos voláteis suscetíveis de indicar diferenças ou semelhanças entre as amostras estudadas. Através deste método verificou-se a existência de dois grupos bem definidos, ou seja, obteve-se uma separação entre o grupo controlo e os grupos oncológicos, tanto para as amostras salivares como para as amostras urinárias.
Através da aplicação do método MCCV, os modelos PLS-DA obtidos forneceram uma boa taxa de classificação, sensibilidade e especificidade.
Com este estudo foi possível verificar que existem diferenças metabolómicas entre indivíduos saudáveis e pacientes oncológicos e ainda entre os dois tipos de cancro estudados. Os resultados obtidos neste trabalho apoiam a hipótese de que determinados metabolitos voláteis poderão ser úteis como ferramenta de diagnóstico pois possivelmente são produzidos ou consumidos em pacientes com cancro e excretados através da saliva ou da urina. No entanto, para validar este estudo é necessário analisar um maior número de amostras de pacientes oncológicos e de indivíduos saudáveis. A facilidade na colheita e armazenamento de saliva e de urina será uma grande vantagem para esta abordagem.
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