Para a análise estatística multivariada das amostras salivares foram selecionados metabolitos com frequência de ocorrência igual ou superior a 70%. Assim, foram selecionados 11 metabolitos para o grupo dos pacientes com cancro da mama e 15 metabolitos para o grupo dos pacientes com cancro do pulmão.
Inicialmente foram testados dois tipos de normalização, a normalização por média e por quartil. O tipo de normalização selecionado para explicar os resultados foi a normalização por quartil, visto que os resultados obtidos por esta normalização foram mais satisfatórios e permitiram obter uma separação mais eficiente dos grupos em estudo. O objetivo da normalização por quartil é fazer com que a distribuição das médias das áreas de cada metabolito seja idêntica em todas as amostras [179]. Desta forma, cada amostra foi normalizada por quartil, sendo posteriormente efetuado o scaling (processo de pré-tratamento que dá às variáveis o mesmo peso [139]).
Posteriormente, utilizou-se o método estatístico PLS-DA para verificar a distribuição das variáveis dos grupos controlo e oncológicos e para identificar metabolitos voláteis que possam indicar diferenças ou similaridades entre as amostras estudadas. Além da metodologia PLS-DA foi realizado o método MCCV de modo a obter o poder preditivo, a taxa de classificação, a sensibilidade e a especificidade do modelo estatístico.
3.2.2.1. Análise Multivariada aplicada à matriz de dados dos VOMs identificados na saliva de pacientes com cancro da mama
Os resultados obtidos referentes às amostras salivares do grupo controlo e do grupo dos pacientes com cancro da mama são mostrados na Figura 17A.Esta figura apresenta ográfico de scores das duas primeiras variáveis latentes (LV1 x LV2), enquanto a Figura 17B (correspondente ao gráfico de pesos das componentes LV1 e LV2) identifica a contribuição de cada metabolito volátil na distinção observada.
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Pela Figura 17A podemos observar que existem dois grupos bem definidos, estando o grupo controlo associado principalmente a valores negativos de LV1 e o grupo dos pacientes com cancro da mama a valores positivos no LV1. O grupo oncológico é maioritariamente caracterizado pelo metabolito ácido benzeno carboxílico, como se pode verificar pela Figura
17B. Alguns investigadores sugerem que este metabolito poderá estar presente
endogenamente nos mamíferos, incluindo os humanos, como parte do ácido hipúrico [180, 181]. Por outro lado, o grupo controlo é caracterizado principalmente pelo 2-cloro-fenol, 3- bromo-fenol, fenol e pelo p-tert-butilfenol.
De acordo com os dados estatísticos obtidos pelo MCCV, o modelo PLS-DA deteve uma taxa de classificação de 91,4% e mostrou 97,4% de sensibilidade (≅ 2,6% dos pacientes com cancro da mama foram classificado erradamente como controlos) e 77,7% de especificidade (≅ 22,3% de falsos positivos). O valor Q2, (expressão da validação cruzada da
variabilidade explicada) mais frequente foi à volta de 0,4 (Figura 18), com prevalência dos valores no intervalo de 0,3-0,7.
Figura 17- Gráfico de scores PLS-DA LV1 x LV2 (A) e gráfico de pesos das
componentes LV1 e LV2 (B) da saliva de pacientes com cancro da mama (CM) e de indivíduos saudáveis (CTL) usando um subconjunto de 11 metabolitos: acac- ácido acético; acpp- ácido propanoico; ac2mpp- ácido 2- metil-propanoico; acbt- ácido butanoico; ac3mpt- ácido 3-metil-pentanoico;
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3.2.2.2. Análise Multivariada aplicada à matriz de dados dos VOMs identificados na saliva de pacientes com cancro do pulmão
Os resultados alusivos às amostras salivares do grupo controlo e do grupo dos pacientes com cancro do pulmão estão expostos na Figura 19A. Através desta figura verifica-se claramente a existência de dois grupos distintos, dos quais o grupo controlo é associado aos valores negativos no LV1 e o grupo dos pacientes com neoplasia do pulmão aos valores positivos no LV1. Através Figura 19B podemos visualizar que o ácido pentanoico, o ácido hexanoico, o 2-bromo-fenol e o 4-metil-fenol são os metabolitos com maior peso na caracterização do grupo oncológico.
Figura 18- Distribuição dos valores do Q2 da validação cruzada de Monte Carlo
original e permutada para o PLS-DA da saliva de pacientes com cancro da mama do subconjunto de 11 metabolitos.
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Tanto o ácido pentanoico como o ácido hexanoico poderão ser produzidos no intestino através da fermentação de hidratos de carbono realizada especialmente por bactérias do género Bacteroides [164]. Em relação ao ácido hexanoico, Huang e seus colaboradores [182] verificaram que este metabolito apresentou uma diferença significativa entre pacientes com cancro gastro-esofágico, grupo positivo (indivíduos com doenças não-cancerosas do trato gastrointestinal superior) e grupo saudável. Estes investigadores observaram que as concentrações do ácido hexanoico foram superiores no grupo oncológico [182]. De modo semelhante, no estudo presente verificou-se que o ácido hexanoico foi detetado em todos os pacientes com cancro do pulmão e detetado em apenas um indivíduo saudável, como se pode constatar na Tabela C, pág.122 em anexo no formato digital. No entanto, no trabalho realizado por Silva et al [3] foram reportados níveis de ácido hexanoico mais baixos na urina de pacientes com cancro colorrectal, leucemia e linfoma, quando comparados com indivíduos
Figura 19- Gráfico de scores PLS-DA LV1 x LV2 (A) e LV1 gráfico de pesos das
componentes LV1 e LV2 (B) da saliva de pacientes com cancro do pulmão (CP) e de indivíduos saudáveis (CTL) usando um subconjunto de 15 metabolitos: acac- ácido acético; ethx- 2-etil-1-hexanol; acpp- ácido propanoico; ac2mpp- ácido 2-metil- propanoico; acbt- ácido butanoico; 2clfenl- 2-cloro-fenol; ac3mpt- ácido 3-metil- pentanoico; acpt- ácido pentanoico; ac4mpt- ácido 4-metil-pentanoico; 3brfenl- 3- bromo-fenol; achx- ácido hexanoico; 2brfenl- 2-bromo-fenol; fenl- fenol; 4mfenl- 4- metilfenol; tbtf- p-tert-butilfenol.
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saudáveis. Contudo, há que considerar que a matriz biológica (saliva) utilizada neste trabalho difere da matriz (urina) usada por Huang et al e Silva et al.
Os bromofenóis, incluindo o 2-bromo-fenol, têm sido encontrados diversos organismos marinhos, mais precisamente em peixes, crustáceos e moluscos [183-185]. Assim, podemos supor que o 2-bromo-fenol tem origem exógena, ou seja deriva da dieta alimentar.
Os cresóis, derivados mono metilados do fenol, são detetados nos humanos em tecidos ou na urina após inalação ou exposição dérmica ou oral [186, 187]. O 4-metilfenol forma-se endogenamente através do metabolismo da tirosina pela microflora presente no intestino [188]. O potencial carcinogénico dos cresóis ainda não está totalmente avaliado. Contudo, existem dois estudos que indicam que os cresóis são promotores de tumores em roedores [189, 190]. O 4-metilfenol foi detetado neste trabalho em aproximadamente 85% dos pacientes com cancro do pulmão e em cerca de 37% dos indivíduos sem neoplasia (ver
Tabela C em anexo formato digital, pág.122). Com isto, podemos colocar a hipótese deste
metabolito estar relacionado com a formação de tumores.
Na análise por MCCV, o modelo PLS-DA possuiu uma taxa de classificação de 95,5% e mostrou 100% de sensibilidade (0% dos pacientes com cancro da mama foram classificado erradamente como controlos) e 91,8% de especificidade (≅ 8,2% de falsos positivos). O valor
Q2 mais comum foi à volta de 0,8 (Figura 20), com predomínio dos valores no intervalo de
0,7-0,9.
Figura 20- Distribuição dos valores do Q2 da validação cruzada de
Monte Carlo original e permutada para o PLS-DA da saliva de pacientes com cancro do pulmãodo subconjunto de 15 metabolitos.
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