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2.7.2.1. Teste de alodínia mecânica (Von Frey eletrônico)

Os possíveis efeitos antinociceptivos centrais ou locais da gabapentina em animais neuropáticos foram determinados através de medição do limiar de retirada da pata, em gramas, induzido por pressão gradativa na superfície plantar da pata ipslateral (direita) e pata contra-lateral controle (esquerda). Foi utilizado um analgesímetro digital (Insight®) (ver figura 16). O operador sustentando o braço do transdutor (analgesímetro) produz um aumento de força gradativo e linear aplicado por um pino sensor de 1,0 mm sobre a superfície plantar da pata. Quando o animal não suporta mais a pressão, retirando a pata, o transdutor registra a pressão neste momento, ou seja, registra o limiar de retirada da pata (LRP) em gramas. Logo após a retirada da pata pelo animal ocorre manifestação de dor através da expressão conhecida como Flick (movimento vacilante da pata). Para cada pata foram feitas duas medidas e obtida uma média. Durante o experimento os animais são contidos em gaiolinhas com fundo de tela de arame através da qual se introduz o pino sensor na superfície plantar medial da pata. Os animais eram observados em sala silenciosa e pouco iluminada, na sala de estudo da dor (LAFICA- UFC). E com um período prévio para aclimatação dos animais neste novo ambiente por 10 minutos. Ver figura 17.

Protocolo e grupos experimentais: Para este experimento utilizamos 60 ratos “Wistar” em quatro grupos: Um grupo neuropático (n = 10) tratado com o diluente (Salina), um grupo pseudo-operado (Sham, n=14) e quatro grupos tratados com a Gabapentina 30, 60, 120 e 240 mg (n = 10, 9, 13, 5 respectivamente). Para cada animal, as medições foram repetidas duas vezes em cada pata e obtida uma média. Os animais foram testados quando estavam com 5 dias de evolução da neuropatia. As medidas do Limiar de Retirada da Pata Figura 17: (A) Equipamento e (B) gaiola de contenção para teste de sensibilidade

mecânica (Von Frey). (C) Esquema simplificado da aplicação do teste.

A B

(LRP) em gramas eram obtidas depois de 80 minutos de aplicada a GBP via gavagem. Ver figura 18.

2.7.2.2. Teste de sensibilidade térmica ao frio (10ºC, teste da acetona)

Para verificação de alodinia térmica ao frio, sinal clínico característico na dor neuropática, utilizamos o modelo descrito por FLATTERS & BENNETT (pag. 151, 2004), um teste no qual se utiliza a propriedade volátil da acetona para induzir a sensação de frio (10ºC). No modelo, os animais foram colocados em gaiolas suspensas com um piso fenestrado composto por malha metálica, que podia ser visto de um espelho colocado em inclinação de 45° com a superfície, abaixo da gaiola. Após um período de aclimatação de 5 min., uma alíquota de 0,05mL de acetona era recolhida de um estoque com uma seringa de 1mL e então era lançada sob a superfície ventral da pata do animal através do piso fenestrado, por meio de propulsão no êmbolo da seringa. Se a pata do animal estivesse corretamente molhada pela acetona, iniciava-se um período de observação inicial de 20s, no qual o animal poderia ou não apresentar comportamentos relacionados à dor (descritos adiante). Se não, a

Tempo

Constrição do Ciático Medida do LRP

(tempo zero)

1 dia antes Zero dia GBP 80 min antes da cirurgia GBP v.o. diariamente de 12 / 12 hs Medida do LRP 80 min depois da GBP 5º dia 3º dia Medida do LRP 80 min depois da GBP

Figura 18: Protocolo para teste de sensibilidade mecânica (Von Frey). O Limiar de retirada da pata (LRP) foi obtido antes, no 3º e 5º dia após a CCNC.

observação da pata se encerrava no fim desse tempo inicial e o observador seguia para a outra pata ou para outro animal; se sim, o observador adicionava mais 20s ao tempo de observação para observar mais algum comportamento do animal. Os comportamentos foram avaliados de acordo com a classificação da referência desse método, em uma escala de 4 pontos assim apresentada: escore “0” para a ausência de qualquer comportamento doloroso; escore “1” para uma retirada rápida da pata e/ou com tremor ou batimento desta no chão (o tremor característico, ou flicking, era importante para determinar se a retirada da pata se deu por dor ou por espanto do animal); escore “2” para um retirada com sustentação prolongada da pata com ou sem repetido flicking desta, e escore “3” para a situação onde o animal lambe a face ventral da pata após flicking repetido da pata. Ver figura 19.

Protocolo e grupos experimentais: Para este experimento utilizamos 60 ratos “Wistar” em quatro grupos: Um grupo neuropático (n = 10) tratado com o diluente (Salina) e quatro grupos tratados com a gabapentina 30, 60, 120 e 240 mg (n = 10 para cada grupo). O teste era conduzido em seqüência entre os vários animais do grupo, de modo que os períodos de descanso das patas fossem de no mínimo 5 minutos. Eram realizadas três medidas em cada

pata por teste (com a soma dos escores de cada pata ao final totalizando no máximo 9 pontos). Os animais foram experimentados antes da cirurgia e no 3º e 5º dia de evolução da neuropatia. As medidas eram obtidas depois de 80 minutos de aplicada a GBP via gavagem. Protocolo semelhante ao teste da alodínia mecânica, visto acima na figura 18.

2.7.2.3. Teste de sensibilidade térmica ao calor de 46° (Hiperalgesia Térmica)

Para o estudo da hiperalgesia utilizamos a temperatura de 46°. Em nosso método de avaliação da sensação térmica quente, os animais eram colocados em uma rede de contenção e ficavam estabilizando durante 2 minutos (correção: 20 min.). Com um pequeno recipiente (50ml) se coletava água a partir de um banho isolado termicamente e com temperatura controlada (46ºC). A pata posterior do animal era submergida na água do pequeno recipiente até o calcâneo (tornozelo) e se aguardava alguma resposta do animal até no máximo 15 segundos (tempo de Cut Off) quando era retirado o recipiente. As imersões da pata na água a 46ºC eram feitas com intervalos de 5 minutos, com duas repetições, a partir das quais era calculado uma média. A duração de tempo de permanência da pata na água até a retirada da mesma pelo animal era registrada em cronômetro e denominada como o Tempo de Latência de Retirada da pata (TLR), medida em segundos. Ver figura 20.

Protocolo e grupos experimentais: Para este experimento utilizamos 60 ratos “Wistar” em quatro grupos: Um grupo neuropático (N = 15) tratado com o diluente (Salina) um grupo Sham (pseudo-operado, N = 18) e quatro grupos tratados com a Gabapentina 30, 60, 120 e 240 mg/kg.p.v.(N = 10, 9, 14, 5 respectivamente). Para cada pata as medições foram repetidas duas vezes e obtida uma média. Os animais foram testados, quanto à pata esquerda e direita, antes da cirurgia e no 3º e 5º dia de evolução da neuropatia. As medidas eram obtidas depois de 80 minutos de aplicada a GBP via gavagem.