Uma maior compreensão da expressão de receptores hormonais ao longo do ciclo estral pode ser obtida pela avaliação imunoistoquímica do endométrio bovino, para tanto se faz necessária à colheita de fragmentos endometriais pela via transcervical. Nesta técnica podem ser utilizadas pinças do tipo Yomann, possibilitando a obtenção de fragmentos uterinos em qualquer momento do ciclo estral. Mann & Lamming (1994) com a técnica de biópsias transcervicais colheram fragmentos endometriais, e concluíram que as colheitas realizadas entre os dias 13 e 17 após o estro não resultaram em um encurtamento da duração do ciclo estral, e também não induziram a liberação de PGF2α. Estes achados nos mostram que esta técnica pode ser uma ferramenta importante para o estudo das modificações fisiológicas ao longo do ciclo estral.
McCarty et al. (1985) relataram que o uso de técnicas histoquímicas para a localização de receptores esteróides, como o estrógeno, têm levado a um aumento da
sensibilidade e especificidade quando comparados aos métodos bioquímicos. O uso da técnica histoquímica demonstrou ter boa correlação com ensaios bioquímicos, embora a distribuição de células negativas e positivas e sua intensidade só possam ser avaliadas nesta técnica.
A técnica de imunoistoquímica possui inúmeras vantagens sobre os ensaios de extração. Entre essas, a pequena quantidade de material requerida e a possibilidade de caracterização histológica das células que contém o receptor, são as mais importantes (De Cock et al., 1997 apud Brito, 2004).
A estrutura e funções do útero são influenciadas pelos hormônios esteróides ovarianos, como o estrógeno e progesterona, os quais mediam sua ação através de receptores específicos (Tsai & O’Malley, 1994). As modificações da ação do hormômio esteróide no útero aparentam ser ditadas pela concentração de seus receptores, que variam durante o ciclo estral (Stormshak, 1979). Todos os tecidos alvo que respondem aos hormônios esteróides contêm um receptor protéico no interior da célula, o qual se liga especificamente ao hormônio ativador. Dentro da célula alvo, o hormônio esteróide é encontrado no citoplasma, ligado a uma proteína relativamente grande. Tal ligação resulta na transfromação ou ativação do complexo proteína-esteróide, permitindo que ele se mova (translocação) para o núcleo da célula. No sítio nuclear, o complexo esteróide se liga a um receptor específico, causando uma seqüência de respostas fisiológicas para aquela célula (Hafez et al., 2000).
Os anticorpos monoclonais produzidos com seqüência de aminoácidos idêntica àquelas expressas nos receptores de estrógeno humanos, reagem com receptores estrogênicos de outras espécies, provando que este epítopo é conservado em muitas espécies (Traish et al., 1990 apud Brito, 2004). De Cock et al. (1997) apud Brito (2004) demonstraram reação dos anticorpos anti-receptores de estrógeno humano com o receptor de estrógeno canino, provando a possibilidade da utilização dos anticorpos comercialmente disponíveis para a detecção dos receptores em tecidos de cães.
Os efeitos da progesterona foram demonstrados na proliferação e diferenciação celular nos órgãos alvo após sua ligação ao receptor de progesterona (Clark & Southerland, 1990), ou seja, a atividade biológica da progesterona é mediada pela modulação da atividade transcripcional dos dois receptores de progesterona, A e B. Ambas as isoformas foram propostas no oviduto de galinhas e no câncer de mama humano (Kastner et al., 1990 apud Fujimoto et al., 1997). O receptor de progesterona A e B possuem diferentes atividades de transcrição (Vegeto et al., 1993 apud Fujimoto et al., 1997; Mulac-Jericevic & Connely, 2004), contudo ambas provêm do mesmo gene (Mulac-Jericevic & Connely, 2004). A isoforma B pode ser mais eficiente como um regulador transcripcional que a isoforma A
(Wen et al., 1994 apud Fujimoto et al., 1997). Portanto, a isoforma B é considerada como crítica para a proliferação celular. A isoforma A age como um repressor da função da isoforma B e da função de outros receptores esteróides (Vegeto et al., 1993 apud Fujimoto et al., 1997), especialmente a atividade transcripcional do receptor de estrógeno humano (Tora et al., 1988 apud Fujimoto et al., 1997). Os subtipos A e B são diferentemente expressos no epitélio ou células do estroma, e a proporção entre eles se modifica durante o ciclo menstrual (Wang et al., 1998 apud Classen-Linke et al., 2000).
A importância fisiológica da manutenção de uma correta relação ente a expressão das isoformas do receptor de progesterona no útero é indicada pela presença de proporções aberrantes das isoformas em cânceres endometriais humanos (De Vivo et al., 2002 apud Mulac-Jericevic & Connely, 2004).
Sabe-se que a ação do estrógeno é mediada por receptores intracelulares, os quais, assim como os de progesterona, são membros de uma superfamília de receptores esteróide/tireóide. Kuiper et al. (1996) relataram um novo clone na família dos receptores nucleares com alta homologia ao receptor de estrógeno, o qual recebeu a denominação de
receptor de estrógeno β, para diferenciá-lo do clone α previamente descrito. Em bovinos,
Walther et al. (1999) clonaram uma nova proteína proveniente das células da granulosa pela combinação de diversos RT-PCRs; esta possuía uma alta homologia a seqüência de receptor
de estrógeno β de outras espécies. Dessa forma, dois tipos predominantes de receptores já
foram caracterizados, os receptores de estrógeno α e β (Kuiper et al., 1996; Rosenfeld et al.,
1998; Walther et al., 1999). Alguns estudos demonstram ainda que o receptor de estrógeno α é
o subtipo mais importante na regulação das atividades uterinas (Couse & Korach, 1999; Muramatsu & Inoue, 2000).
Classicamente, o estradiol exerce suas funções se ligando a seus receptores, que funcionam como fatores de transcrição (Mangelsdorf et al., 1995; Mowa & Iwanga, 2000a,b) e, portanto, estimulam a transcrição gênica e a síntese de novas proteínas (Ho & Liao, 2002). Segundo Razandi et al. (1999) a maior ação dos hormônios esteróides ocorre pela ativação dos receptores de estrógeno nucleares que ocasionam efeitos na transcrição de genes específicos. Os receptores de estrógeno nucleares regulam a transcrição gênica por se ligarem a seqüências específicas do DNA e estimularem ou inibirem a expressão de um determinado gene. De fato, Acconcia e Marino (2003), verificaram que a ação genômica do estrógeno na célula é promovida pelo complexo estrógeno-receptor que ativa fatores transcripcionais ligados ao DNA. Os mesmo autores verificaram haver um sinergismo entre a ação molecular genômica e não genômica do estrógeno induzindo a transcrição de genes.
Bertan (2004) relatarou o aumento das concentrações de PGFM cerca de 3 a 5,5 horas após a injeção de estradiol, e sugeriu que a ação deste hormônio deveria envolver uma via genômica, possivelmente estimulando a síntese de proteínas envolvidas na cascata
geradora de PGF2α.
A concentração de receptores de estrógeno durante o ciclo estral de vacas foi significativamente maior durante o proestro, estro e após o estro (dias 18 a 20 e 0 a 4) do que durante a fase luteal média (9 a 14). Este aumento na concentração dos receptores de estrógeno é paralelo ao aumento da concentração plasmática e tecidual de estradiol, e estes, por sua vez são inversamente relacionados ao nível plasmático de progesterona. Dessa forma os autores concluíram, que se o nível plasmático de progesterona influencia os níveis de receptores de estrógeno, a progesterona deve fazer o tecido menos responsivo aos estrógenos ovarianos (Henricks & Harris, 1978). Os mesmos autores relataram que em vacas ovariectomizadas, a concentração de receptores de estrógeno foi similar aos encontrados em vacas cíclicas nos dias 1 a 4 e 18 a 20. Nestes animais, enquanto os níveis plasmáticos de progesterona e estradiol eram baixos os níveis teciduais de estradiol eram relativamente elevados. Os autores relataram que possivelmente um estímulo mínimo de estradiol seja suficiente para o aparecimento dos receptores de estrógeno, e que como nestes animais os níveis de progesterona estavam ausentes no plasma, a progesterona deva possuir uma influência tão significativa quanto o estradiol sobre os receptores de estrógeno.
Boos et al. (1996) estudaram a distribuição de receptores de estrógeno e progesterona no endométrio bovino pela técnica de imunoistoquímica e, para tanto, foram realizadas coletas de biopsias endometriais nos dias 1, 8, 15 e 19 do ciclo estral. Para ambos os receptores esteróides foi realizada a contagem de núcleos exibindo desde nenhuma marcação até uma marcação muito forte, esses resultados foram aplicados em uma fórmula para se estimar a imunoreatividade do tecido no momento avaliado. Estes mesmos autores relatam que as contagens foram realizadas em vários tipos celulares, como o epitélio de superfície, as aberturas glandulares, o corpo glandular, o estroma superficial e intermediário. De uma forma geral, os resultados encontrados para o receptor de estrógeno demonstraram um efeito significativo para o tipo celular, mas não para o tempo, embora houvesse interação entre essas variáveis; quanto ao receptor de progesterona ambas as variáveis, tipo celular e tempo, foram significativas. No epitélio de superfície houve um aumento significativo para o receptor de estrógeno no dia 15, coincidindo com maiores concentrações plasmáticas de progesterona e, posteriormente, a imunomarcação tendeu a cair; para o receptor de progesterona houve uma imunomarcação máxima no dia 8 e valores menores nos dias 1, 15 e
19. No epitélio glandular houve uma forte imunomarcação no dia 1 quando comparada com os dias 15 e 19, e para a abertura glandular houve ainda diferença significativa entre os dias 8 e 15 para o receptor de estrógeno; já para o receptor de progesterona foi observada uma imunomarcação máxima no dia 8 quando comparada aos dias 15 e 19, embora não diferissem estatisticamente. Quanto ao estroma uterino, houve uma forte imunomarcação para o receptor de estrógeno no dia 1, seguida de uma reatividade decrescente para os dias 8 e 15, embora só significativamente diferente para o estroma intermediário; já para o receptor de progesterona, houve um comportamento quantitativo diferente, uma vez que imunomarcação foi semelhante ao longo dos dias, com uma queda significativa no dia 15. Então, altas concentrações de receptores de progesterona foram vistas no estro, e estas foram máximas alguns dias depois. Com este estudo, Boos et al. (1996) concluíram que os diferentes tipos celulares presentes no endométrio bovino apresentam um padrão diferente de imunomarcação para os receptores de estrógeno e progesterona ao longo do ciclo estral e que o estrógeno irá promover a síntese de receptores esteróides no útero, enquanto a progesterona deve inibir estes receptores, embora algumas exceções tenham sido notadas.
Kimmins & MacLaren (2001) relataram uma marcação moderada para o receptor de progesterona no estroma subepitelial bovino durante proestro (dia 17 a 20 do ciclo estral), durante o estro a expressão de receptores de progesterona foi aumentada e alcançou o estroma frouxo. No dia 3 ocorreu forte marcação no estroma e glândulas, durante o metaestro tardio (dia 6) houve uma diminuição da imunomarcação nas regiões próximas ao epitélio luminal, com uma moderada reatividade presente no estroma compacto e glândulas superficiais, e uma marcação intermediária nas glândulas profundas. Durante o diestro (dias 7 a 16) a expressão foi diminuída, com uma marcação fraca presente no estroma compacto. O receptor de progesterona só foi identificado no epitélio luminal em dois animais nos dias 3 e 6 do ciclo estral. A expressão do receptor de estrógeno foi maior durante os dias 1 a 3 do ciclo estral e menor durante a fase luteal (dias 7 a 17). No dia 18, uma reatividade de moderada a alta foi detectada no estroma compacto e glândulas superficiais, e a expressão aumentou durante o proestro. No estro, a reatividade continuou a aumentar nas glândulas e estroma superficial. Nos dias 1 a 3 a expressão foi máxima e caracterizada por uma alta expressão nas glândulas e estroma. No metaestro tardio (dia 6) os níveis declinaram no estroma compacto e glândulas superficiais, embora a expressão tenha permanecido alta nas glândulas profundas. A expressão de receptores de estrógeno no epitélio luminal se restringiu aos dias 14 e 16 do ciclo estral. Os mesmos autores, trabalhando com vacas ovariectomizadas, relataram que esses animais quando suplementados com estrógeno apresentavam um aumento da expressão
dos receptores de estrógeno e progesterona em comparação aos animais tratados com progesterona.
Robinson et al. (2001) estudaram a expressão de receptores de progesterona e
estrógeno α e de seus RNAm através de imunocitoquímca e de hibridização in situ,
respectivamente. Desta forma concluíram que o RNAm para o receptor de estrógeno apresenta-se regulado pelo tempo no epitélio glandular superior, e apresenta a tendência de ser regulado pelo tempo no epitélio luminal. Ambas as regiões apresentaram maior expressão durante o estro, com uma queda no dia 2 do ciclo estral e um novo aumento durante o início da fase luteal (aproximadamente durante os dias 4 a 10 do ciclo estral), com a menor concentração do meio para o fim da fase luteal (dias 12 a 16) e voltaram a aumentar após o dias 16 do ciclo. Quanto ao receptor, este foi regulado pelo tempo no epitélio luminal, no epitélio glandular superficial e profundo. No epitélio luminal a máxima expressão ocorreu durante o estro e meio da fase luteal (dias 10 a 14), com uma baixa concentração observada nos dias 6 e 16, sendo que após o dia 16 houve um aumento semelhante ao observado no estro. No epitélio glandular superficial foi observado máxima concentração no dia 0 e 2, com um declínio entre os dias 4 a 16 quando ocorreu um novo aumento. Para o epitélio glandular profundo as concentrações máximas também foram observadas nos dias 0 e 2, posteriormente houve um pequeno declínio, mas permaneceu elevada durante todo o ciclo. Essas evidências sugerem que antes do 16º dia do ciclo estral o número insuficiente de receptores de estrógeno α no endométrio poderia representar um fator limitante para que o mesmo estimulasse a
síntese de PGF2α. O RNAm para receptor de progesterona foi evidenciado principalmente no
estroma subepitelial e nas glândulas superficiais, e em menor concentração no epitélio luminal. Para o estroma subepitelial e epitélio glandular houve um efeito temporal, e em ambos o RNAm foi expresso moderadamente no estro e esta expressão foi mantida durante a fase luteal inicial, entre os dias 8 a 10 do ciclo estral começou a declinar e permaneceu baixo durante toda a fase luteal restante, aumentando apenas ao redor dos dias 15 e 16 para alcançar um nível semelhante ao do estro no dia 21. Quanto ao receptor de progesterona, este foi evidenciado no núcleo das glândulas superficiais e no estroma subepitelial, em ambos regulado pelo tempo. No epitélio luminal foi localizado apenas no dia 6 do ciclo estral em alguns animais. No epitélio de glândulas superficiais a marcação foi baixa no estro, aumentou durante a fase luteal inicial e alcançou um pico entre os dias 6 e 8, logo após houve um decréscimo gradual e não foi mais detectado entre o dia 12 e 20 do ciclo. Para o estroma subepitelial a maior expressão foi observada do dia 0 ao 8 e a menor durante o meio para o fim da fase luteal.
Robinson et al. (2001) relataram ainda que há diferenças nos padrões de expressão para o receptor de progesterona e seu RNAm no epitélio de glândulas superficiais, a concentração do RNAm aumentou durante a fase folicular mas o aumento do receptor só ocorreu no estro, o que indica uma regulação pós-transcripcional também do receptor de
progesterona. Os autores concluíram que tanto o receptor de estrógeno α como o de
progesterona e o RNAm para ambos foi geralmente maior durante o estro e baixo durante a fase luteal.
Contudo, algumas exceções devem ser notadas, como a concentração do receptor
de estrógeno α no epitélio luminal que apresentou concentrações semelhantes ao do estro no
meio da fase luteal (Robinson et al., 2001), sendo que o mesmo foi observado por Boos et al. (1996), contrariando os achados em ovelhas (Wathes & Hamon, 1993; Spencer & Bazer, 1995). Outra exceção diz respeito ao padrão diferente observado para o receptor de estrógeno α e seu RNAm no epitélio de glândulas superficiais, enquanto o RNAm aumentou durante o início da fase luteal, a concentração do receptor estava declinando, o que sugere que o
receptor de estrógeno α é regulado após a transcrição (Robinson et al., 2001). Mais uma
exceção verificada é a alta expressão de receptores de estrógeno α em glândulas profundas
durante todo o ciclo estral (Robinson et al., 2001), também observada em ovelhas (Wathes & Hamon, 1993; Spencer & Bazer, 1995). Segundo Robinson et al. (2001) estes receptores podem ser requeridos para estimular a secreção glandular ou para passar a informação referente às concentrações plasmáticas de estradiol para os outros tipos celulares.
Vários autores, com o uso de métodos bioquímicos, demonstram maior quantidade de receptores de estrógeno próximo ao estro e mínimas ao redor do dia 15 do ciclo estral (Meyer et al., 1988; Vesanen et al., 1988; Schneider, 1989; Vesanen et al., 1991).
De forma contrária à maioria dos trabalhos, Kimball & Hansel (1974) relataram ainda em bovinos um significativo aumentou na concentração do receptor de estrógeno entre os dias 15 a 21 do ciclo estral quando comparado aos dias 2, 5 e 10.
Por sua vez, Breeveld-Dwarkasing et al. (2002), estudando a distribuição de receptores de progesterona e estrógeno no cérvix de vacas não-gestantes, relataram que a proporção de células que expressam esses receptores aumenta do epitélio para o estroma subepitelial e deste para o estroma profundo. Observaram ainda que não houve correlação entre os níveis séricos de progesterona, a concentração tecidual de estrógeno e a imunomarcação para os receptores. Adicionalmente, relataram uma forte correlação entre a expressão do receptor de progesterona e de estrógeno no estroma subepitelial e profundo. Os
autores concluíram, portanto, que no cérvix a expressão destes receptores não é controlada simplesmente pelos esteróides circulantes ou pela concentração hormonal tecidual.
Xiao & Goff (1999) estudaram a regulação hormonal dos receptores de estrógeno e progesterona em cultivo de células endometriais bovinas, e concluíram que o número de receptores de progesterona foi maior nas células do estroma que nas epiteliais, enquanto que o número de receptores de estradiol foi maior nas células epiteliais do que no estroma. Os mesmos autores ainda demonstraram que o estradiol aumenta a concentração do seu próprio receptor e do receptor de progesterona em ambos os tipos celulares in vitro, enquanto que a progesterona possui pouco efeito, mas inibe os efeitos do estradiol sobre os receptores de progesterona. Foi ainda relatado que a progesterona não inibiu a ação estimulatória sobre o seu próprio receptor nas células epiteliais, demonstrando uma diferença na regulação do receptor entre os tipos celulares, ou que o efeito negativo sobre o receptor de estrógeno no epitélio luminal é mediado pelas células do estroma.
Através de ensaios de ligação em endométrio ovino, Koligian & Stormshak (1977a) relataram que a ligação nuclear específica do estradiol em ambos os cornos uterinos foi maior nos dias 0 e 3 do ciclo estral, do que nos dias 6 e 10. A ligação nuclear do estradiol foi significativamente maior no endométrio do corno uterino ipsilateral ao ovário contendo o corpo lúteo que no corno contralateral no dia 10. Os autores relataram que a redução observada nos receptores nucleares de estrógeno durante a fase luteal do ciclo estral de ovelhas pode ter ocorrido pela exposição do útero a progesterona. Porém Wathes et al. (1996) relataram diferenças na resposta ao tratamento com progesterona entre ovelhas ovariectomizadas e cíclicas, sendo que nos animais ovariectomizados a progesterona não diminuiu os receptores de estrógeno como observado nas ovelhas cíclicas, sugerindo que fatores ovarianos além da progesterona devem estar envolvidos na regulação do receptor de estrógeno.
Em ovelhas ovariectomizadas tratadas com um única injeção de 50 µg de17β-
estradiol ou com um regime de estradiol-progesterona-estradiol, designado para mimetizar o ciclo estral, Ing et al. (1996) concluíram que o estradiol aumentou o RNAm para o receptor de estrógeno em 5 vezes, 24 horas após a sua aplicação; este efeito também foi verificado após um período de dominância progesterônica (grupo estradiol-progesterona-estradiol). Também foi demonstrado que o tratamento com estradiol aumentou o RNAm para receptor de progesterona após 48 horas.
Em gatas ovariectomizadas, West et al. (1976) estudaram a expressão dos receptores de estrógeno, e concluíram que no oviduto e útero o tratamento com estradiol
causou uma elevação nos receptores de estrógeno. Já o tratamento com a progesterona, em animais previamente tratados com estrógeno ou não, reduziu a concentração de receptores de estrógeno aos níveis presentes nos animais ovariectomizados. Dessa forma, o autor concluiu que a progesterona suprimiu o receptor de estrógeno no oviduto e útero de gatas.
Re et al. (1995) estudaram a distribuição dos receptores de estrógeno e progesterona no trato genital de éguas e relataram que a concentração destes receptores foi menor na vagina e cérvix do que no útero e particularmente, nos cornos uterinos, similarmente ao que ocorre em vacas (Re et al., 1989; Vesanen et al., 1991) e em porcas (Re et al., 1990). Além disso, esses mesmos autores compararam a presença de receptores em grupos de éguas com diferentes concentrações de progesterona, e concluíram que não houve diferença significativa entre a concentração de receptores de estrógeno nas éguas em fase folicular ou nas éguas em fase luteal, mas as éguas na fase folicular tinham significativamente maior concentração de receptor de progesterona que aquelas na fase luteal. Este comportamento do receptor de estrógeno pode ser parcialmente atribuído ao tipo de estro na