Os resultados da intensidade de marcação para os núcleos positivos para receptor de progesterona no epitélio glandular e estroma uterino estão apresentados nas tabelas 20 e 21 e nas figuras 17 e 18, respectivamente. As figuras 21 e 23 mostram a imunomaracação de receptores de progesterona no epitélio glandular e estroma uterino, respectivamente, em aumento de 1000X.
A observação da intensidade de marcação demonstrou haver diferença entre os grupos avaliados, com uma marcação mais intensa observada no grupo D13 (p = 0,0131). Porém, não foi observada interação entre grupos e dias do ciclo estral avaliados (p = 0,1644), entre grupos e tecidos (p = 0,5398) e entre grupos, tecidos e dias do ciclo estral (p = 0,9998). Foi ainda verificada uma variação ao longo do ciclo estral (p < 0,0001) e entre os dias do ciclo estral e tecidos avaliados (p = 0,0108). Não foi verificada diferença significativa para os tecidos avaliados (epitélio glandular e estroma uterino) (p = 0,2585). O desdobramento demonstrou haver efeito cúbico para o dia.
Tabela 20 – Valores médios e desvios padrão do escore para a intensidade de marcação dos núcleos positivos para receptor de progesterona no epitélio glandular ao longo do ciclo estral nos grupos D0 e D13
EPITÉLIO GLANDULAR
DIA DO CICLO ESTRAL GRUPO D0 GRUPO D13
D0 3,00 ± 1,00 3,00 ± 0,89
D5 3,00 ± 1,41 4,00 ± 0,00
D9 2,63 ± 0,92 3,40 ± 0,89
D13 1,17 ± 0,41 1,33 ± 0,82
Tabela 21 – Valores médios e desvios padrão do escore para a intensidade de marcação dos núcleos positivos para receptor de progesterona no estroma uterino ao longo do ciclo estral nos grupos D0 e D13
ESTROMA UTERINO
DIA DO CICLO ESTRAL GRUPO D0 GRUPO D13
D0 3,67 ± 0,52 3,83 ± 0,41
D5 2,60 ± 0,89 3,71 ± 0,76
D9 2,25 ± 0,89 3,20 ± 0,45
D13 1,00 ± 0,00 1,29 ± 0,49
D19 2,00 ± 1,00 2,00 ± 1,26
Figura 17 – Valores médios do escore para a intensidade de marcação dos núcleos positivos para receptor de progesterona no epitélio glandular ao longo do ciclo estral nos grupos D0 e D13 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 In ten s id ad e d e M a rc ação p a ra o R e c e pt or de P ro ge s te ro na n o E p it él io G lan d u lar D0 D5 D9 D13 D19
Dias do Ciclo Estral
Grupo D0 Grupo D13
Figura 18 – Valores médios do escore para a intensidade de marcação dos núcleos positivos para receptor de progesterona no estroma uterino ao longo do ciclo estral nos grupos D0 e D13 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 In te n s id ad e d e M a rc aç ão p a ra o R e c e pt o r de P roge s te rona no E st ro m a U ter in o D0 D5 D9 D13 D19
Dias do Ciclo Estral
Grupo D0 Grupo D13
5.6.4. Intensidade de marcação para os núcleos positivos para receptor de
estrógeno
Os resultados da intensidade de marcação para os núcleos positivos para o receptor de estrógeno no epitélio glandular e estroma uterino estão apresentados nas tabelas 22 e 23 e nas figuras 19 e 20, respectivamente. As figuras 22 e 24 mostram a imunomaracação de receptores de estrógeno no epitélio glandular e estroma uterino, respectivamente, em aumento de 1000X.
A avaliação da intensidade de marcação para o estrógeno demonstrou que esta variável se modificou durante o ciclo estral (p < 0,0001) e entre os dias do ciclo estral e os tecidos avaliados (p = 0,0009), contudo, não houve diferença significativa entre os dias do ciclo estral e os grupos avaliados (p = 0,135). Foi ainda observada a ausência de diferença entre os grupos (D0 e D13) (p = 0,6482) e tecidos avaliados (p = 0,1256), entre os tecidos e grupos estudados (p = 0,8717) e entre os tecidos, grupos e dias (p = 0,9090). O desdobramento demonstrou haver efeito cúbico para o dia.
Tabela 22 – Valores médios e desvios padrão do escore para a intensidade de marcação dos núcleos positivos para receptor de estrógeno no epitélio glandular ao longo do ciclo estral nos grupos D0 e D13
EPITÉLIO GLANDULAR
DIA DO CICLO ESTRAL GRUPO D0 GRUPO D13
D0 3,60 ± 0,55 3,33 ± 0,52
D5 3,20 ± 0,84 3,00 ± 0,89
D9 3,50 ± 0,93 2,75 ± 0,96
D13 2,33 ± 1,21 2,83 ± 0,75
D19 1,60 ± 0,55 2,75 ± 0,50
Tabela 23 – Valores médios e desvios padrão do escore para a intensidade de marcação dos núcleos positivos para receptor de estrógeno no estroma uterino ao longo do ciclo estral nos grupos D0 e D13
ESTROMA UTERINO
DIA DO CICLO ESTRAL GRUPO D0 GRUPO D13
D0 4,00 ± 0,00 3,83 ± 0,41
D5 3,60 ± 0,55 3,67 ± 0,52
D9 3,13 ± 0,99 2,40 ± 0,55
D13 2,00 ± 0,00 2,14 ± 0,38
Figura 19 – Valores médios do escore para a intensidade de marcação dos núcleos positivos para receptor de estrógeno no epitélio glandular ao longo do ciclo estral nos grupos D0 e D13
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 In te n si d a d e d e M ar ca ção p ar a o R e c e pt or de E s tr ó g e n o no E p it él io G lan d u lar D0 D5 D9 D13 D19
Dias do Ciclo Estral
Grupo D0 Grupo D13
Figura 20 – Valores médios do escore para a intensidade de marcação dos núcleos positivos para receptor de estrógeno no estroma uterino ao longo do ciclo estral nos grupos D0 e D13
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 In ten s id ad e d e M a rc aç ão p a ra o R e c e pt o r de E s tr óge no n o E s tr o m a U ter in o D0 D5 D9 D13 D19
Dias do Cilo Estral
Grupo D0 Grupo D13
Figura 21 – Marcação imunoistoquímica de receptores de progesterona no epitélio glandular do endométrio de vacas Nelore nos dias 0 (A), 5 (B), 9 (C), 13 (D) e 19 (E) do ciclo estral. Aumento de 1000X A C B D E
Figura 22 – Marcação imunoistoquímica de receptores de estrógeno no epitélio glandular do endométrio de vacas Nelore nos dias 0 (A), 5 (B), 9 (C), 13 (D) e 19 (E) do ciclo estral. Aumento de 1000X A C B D E
Figura 23 – Marcação imunoistoquímica de receptores de progesterona no estroma uterino vacas Nelore nos dias 0 (A), 5 (B), 9 (C), 13 (D) e 19 (E) do ciclo estral. Aumento de 1000X
A
C
B
D
Figura 24 – Marcação imunoistoquímica de receptores de estrógeno no estroma uterino de vacas Nelore nos dias 0 (A), 5 (B), 9 (C), 13 (D) e 19 (E) do ciclo estral. Aumento de 1000X
A
C
B
D
Os intervalos interestro médios encontrados em nosso estudo para os grupos experimentais, encontravam-se dentro da variação de 17 a 25 dias relatada por Sirois & Fortune (1988) e Lamonthe-Zavaleta et al. (1991). Contudo, foram superiores aos obtidos por McDonald (1989), que relataram um intervalo de 22 dias para vacas, e também aos dados de Figueiredo et al. (1997), que relataram um intervalo interovulatório de 20,65 ± 0,46 e 22,00 ± 0,44, para animais da raça Nelore com duas e três ondas de crescimento folicular, respectivamente.
Contudo, alguns animais apresentaram intervalo interestro maiores, compatíveis com os descritos por Wishart (1972) que relataram intervalos superiores a 25 dias.
Não foram observadas diferenças entre os grupos estudados, o que indica que a realização de biopsias endometriais não levou a alteração na duração do ciclo estral.
Não fica claro porque os animais pertencentes ao grupo D13 apresentaram maior intervalo interestro, em comparação aos animais do grupo D0. No grupo D13, até momento da ovulação, haviam sido colhidas duas biopsias, enquanto que no grupo D0 já haviam sido colhidas cinco; portanto, poderíamos considerar que os animais do grupo D0 poderiam ter tido uma liberação prematura de PGF2α. Sabidamente os processos inflamatórios acarretam a liberação de prostaglandina, sendo esta produção aumentada pela liberação de ácido aracdônico dos fosfolipídios das membranas celulares, que poderia estimular a lise do corpo lúteo (Acland, 1998). Contudo, apesar de diferentes, o intervalo interestro é semelhante aos dados descritos na literatura, não caracterizando uma luteólise prematura.
Dessa forma, a estratégia de colheita de fragmentos endometriais do corno contralateral foi eficiente em não alterar a duração do ciclo estral.
Provavelmente, as amostras obtidas foram representativas do endométrio como um todo, visto que, em éguas não há diferença significativa entre a concentração dos receptores de estrógeno e progesterona nos cornos ipsilateral e contralateral ao corpo lúteo (Re et al., 1995).
Para agrupar os estros optou-se pela sincronização de cio. Contudo, foi escolhido o protocolo descrito por Barros et al. (1999), que apesar de sincronizar a emergência da onda e o momento da luteólise, não possui um indutor de ovulação, não interferindo diretamente sobre o diâmetro do folículo ovulatório. O momento médio das ovulações foi 6,00 ± 2,61 (variando entre
3 e 13) dias após a administração da prostaglandina. Este momento foi tardio quando comparado com o obtido por Barros et al. (1999), que mostraram que as ovulações ocorreram dentro de um intervalo de 48h, que se iniciava 72 horas após a aplicação da prostaglandina. Contudo, nesse estudo foi retirado um animal que ovulou no sétimo dia.
Thatcher et al. (1989) relataram que 60 a 70% das vacas sincronizadas por este protocolo foram detectadas em cio dentro de 4 dias após a aplicação de prostaglandina. Neste estudo não foi realizada a detecção de estro e, portanto, não pode ser feita uma comparação direta dos resultados aqui obtidos e os obtidos por Thatcher et al. (1989). Porém, apenas no sexto dia é que foi observada uma taxa de ovulação de 75%, existindo ainda vacas que ovularam no décimo e décimo terceiro dia após a prostaglandina. Levando-se em conta que a ovulação ocorre aproximadamente 24 horas após o início do estro, o momento da ovulação no presente estudo foi posterior aos resultados obtidos por Thatcher et. al. (1989) e Barros et al. (1999).
O diâmetro do folículo ovulatório pós-sincronização e no ciclo subseqüente foram semelhantes (13,50 ± 2,10 e 13,00 ± 1,30 mm, respectivamente). Contudo, foram superiores aos relatados também para vacas Nelore por Figueiredo et al. (1997), que encontraram diâmetros de 12,05 ± 0,29 e 11,61 ± 0,25, respectivamente, para ciclos com duas e três ondas foliculares.
Em animais Bos taurus indicus, Figueiredo et al. (1997) e Rhodes et al. (1995a) relataram diâmetros médios para os corpos lúteos de 17,9 ± 0,40 mm e 18,9 ± 0,17 mm, respectivamente. Contudo, Taylor & Rajamahendran (1991) e Adams et al. (1993), em animais
Bos taurus taurus, encontraram corpos lúteos com diâmetros entre 20 a 25 mm, sendo estes
semelhantes aos encontrados em nosso estudo (20,70 ± 2,40mm).
Os resultados de folículos maiores e ovulações mais tardias sugerem um pico de LH mais tardio, o que nos parece ser um evento fisiológico do Nelore, uma vez que os animais encontravam-se com oferta adequada de alimento, suplementadas com sal mineral e em escore corporal adequado.
Quanto ao perfil hormonal, a literatura demonstra que existe um padrão de elevação do 17β-estradiol relacionado ao crescimento folicular em cada onda (Ireland et al., 1979; Ginther et al., 1989a; Ireland et al., 1984), com os níveis plasmáticos de estradiol na circulação aumentando significativamente durante a fase de desvio (Kulick et al., 1999; Ginther et al., 2000), uma vez que o folículo dominante é o principal responsável por esta produção (Ireland et al., 1984); e com a concentração plasmática máxima momentos antes da ovulação (Glencross &
Pope, 1981). Este padrão de aumento plasmático do 17β-estradiol, acompanhando o crescimento folicular, com concentrações elevadas durante o estro e no meio do diestro, não foram observadas em nosso estudo, no qual não ocorreram modificações significativas ao longo do ciclo estral. Em ovelhas, Koligian & Stormshak (1977) também não observaram diferenças significativas para este hormônio durante o ciclo estral.
Embora nesse estudo não tenha sido possível caracterizar um pico de estradiol próximo ao estro, foi possível observar os efeitos classicamente atribuídos a este hormônio durante o ciclo estral, pelas alterações detectadas por palpação e ultra-sonografia transretal, tais como o aumento do tônus uterino, da heterogeneidade da textura uterina, da coleção líquida no fundo vaginal e cornos uterinos e diminuição da espiralização uterina, além de outros achados como a ovulação e o comportamento de cio (Pierson et al., 1987; Diaz et al., 2002).
Os baixos coeficientes de variação intra e interensaio relacionados as dosagens hormonais sinalizam que os testes foram realizados de forma adequada e, portanto, se os resultados não foram coerentes eles se devem a uma inadequação do kit empregado para avaliações de 17β-estradiol em bovinos.
Para as dosagens plasmáticas de progesterona foram encontrados valores entre 0,06 ng/mL e 4,53 ng/mL, observando-se uma alteração significativa ao longo do ciclo estral, com um uma elevação pós-ovulação, um platô no meio do ciclo e um declínio próximo ao momento da luteólise. Esses resultados são semelhantes aos observados por diversos autores na espécie bovina (Dobson et al., 1975; Lemon, 1975; Zelinski et al., 1982; Mucciolo & Barberio, 1983; Walters et al., 1984; Spano & Silva, 1992; Figueiredo et al., 1997), e aos relatos de Niswender et al. (2000), que afirmam que ao longo do ciclo estral o corpo lúteo aumenta em tamanho e capacidade de liberar a progesterona.
Durante o diestro foram encontrados níveis máximos de 4,53 ng/mL, valor que se encontra dentro dos limites encontrados pela maioria dos autores acima citados para a mesma fase do ciclo estral.
O tônus uterino, avaliado por palpação retal, apresentou-se aumentado durante o período periovulatório, o que provavelmente reflete os níveis elevados de 17β-estradiol. Esse resultado é semelhante ao descrito por Mortimer et al. (1997). Porém, Bonafos et al. (1995) além de relatarem um aumento periovulatório também observaram uma nova elevação entre os dias 4 a 10 (início do diestro), o que não foi observado neste estudo.
Os animais pertencentes aos grupos com colheita de fragmentos endometriais (D0 e D13) apresentaram tônus semelhante ao do grupo controle, porém com elevações episódicas durante o diestro. Provavelmente essas elevações estavam relacionadas à colheita de fragmentos endometriais, que podem ter desencadeado reação inflamatória local discreta e liberação de substâncias inflamatórias, suficientes para acarretarem apenas uma modificação momentânea. Contudo, não fica claro porque os grupos com colheitas de biopsias apresentam diferença entre si, com o grupo D13 apresentando tônus mais elevado.
Durante o ciclo estral o diâmetro dos cornos uterinos, determinado por palpação e ultra-sonografia, foi semelhante nas duas avaliações e variou ao longo do ciclo estral. Foi observado um diâmetro superior no período periovulatório e as menores medidas foram obtidas durante a fase progesterônica. Essas variações também podem ser atribuídas as modificações plasmáticas das concentrações de 17β-estradiol e progesterona. Resultados semelhantes foram encontrados por Pierson et al. (1987), apesar destes terem realizados as avaliações no corpo uterino em novilhas Bos taurus taurus.
A ausência de diferenças entre os grupos experimentais, para estas variáveis, sugere que as colheitas de fragmentos endometriais não influenciaram as variações do diâmetro uterino.
A mesma dinâmica de acúmulo de fluidos nos cornos uterinos e fundo vaginal observada neste estudo durante o ciclo estral foi também verificada por Pierson et al. (1987). Contudo, esses autores relataram uma diminuição gradual do acúmulo intravaginal e mais rápida para o intra-uterino, o que diferiu dos nossos achados, uma vez que observamos um decréscimo mais rápido para o acúmulo intravaginal e mais gradual para o acúmulo nos cornos uterinos.
O maior acúmulo de fluido observado durante o diestro nos grupos D0 e D13 provavelmente, demonstra que a colheita de biopsias influenciou os resultados. Durante a fase estrogênica (fase proliferativa) o cérvix se encontra aberto e o útero tônico, e dessa forma a secreção proveniente dos ovidutos, dos cornos uterino e do cérvix é expulsa e se acumula no fundo vaginal (secreção ativa) até que seja expelida pela vulva; já durante a fase progesterônica (fase secretória) a secreção é menor e o cérvix está fechado, dessa forma não há acúmulo no fundo vaginal, como pode ser observado no grupo controle. A colheita seriada de fragmentos endometriais, realizada durante o diestro, manteve o cérvix permanentemente aberto e pode ter levado a inflamação local com liberação de substâncias inflamatórias, aumento da
permeabilidade vascular e, conseqüentemente, maior acúmulo de líquido intra-uterino e intravaginal.
Semelhante ao observado neste estudo, Pierson et al. (1987) e Bonafos et al. (1995) também observaram uma maior heterogeneidade endometrial nos momentos próximos a ovulação e uma imagem ultra-sonográfica mais homogênea durante a fase de predomínio de progesterona. Contudo, em nosso estudo o aumento da heterogeneidade ocorreu mais precocemente no ciclo estral em comparação aos achados dos autores citados.
Pierson et al. (1987) também relataram um padrão de espiralização uterina, semelhante ao encontrado no presente estudo, com o útero apresentando-se mais espiralado durante a fase de predomínio progesterônico. Entretanto, as modificações observadas por estes autores foram bruscas quando comparadas com os nossos resultados, nos quais as alterações foram continuais e mais graduais.
Para as variáveis, textura e espiralização uterina, não houve efeito da colheita de fragmentos endometriais, demonstrando que esta técnica não as alterou. Esse resultado demonstra que a colheita de biopsias, ainda que capaz de desencadear um processo inflamatório local, o aumento da permeabilidade vascular com o extravasamento de líquido, e edema, não foi capaz de modificar a textura uterina à ultra-sonografia. Dessa forma, podemos supor que a inflamação local foi discreta e insuficiente para acarretar a modificação da textura e espiralização uterina à ultra-sonografia e o tônus uterino no exame de palpação trans-retal.
Na maioria dos cortes histológicos estudados quanto à presença de receptores endometriais de progesterona e estrógeno, não estava visível o epitélio luminal.
Vermeirsch et al. (1999) demonstraram que no endométrio canino, as células do estroma refletem melhor as modificações cíclicas dos hormônios esteróides. No ano seguinte, em outro estudo deste grupo (Vermeirsch et al., 2000) os autores concluíram que as modificações observadas no epitélio luminal são coordenadas pelos efeitos dos esteróides sobre as células do estroma. Estes achados foram também observados por Galabova-Kovacs et al. (2004) em endométrio canino cultivado in vitro. Cooke et al. (1997) e Xiao & Goff (1999) estudando, respectivamente, o endométrio murino e bovino in vitro chegaram a conclusões semelhantes às encontradas por Vermeirsch et al. (2000).
Esses achados sugerem que os resultados encontrados para a expressão dos receptores de estrógeno e progesterona no estroma uterino foram um reflexo das ações dos esteróides
sexuais sobre este tecido. Contudo, não foi possível relacionar a expressão dos receptores no estroma com modificações no epitélio luminal.
A avaliação imunoistoquímica empregada foi capaz de marcar os núcleos que possuíam receptores para os esteróides sexuais femininos. Por ser uma técnica semiquantitativa a presença e a intensidade da marcação refletem, respectivamente, a positividade da célula e a concentração destes receptores. As duas variáveis podem ser utilizadas, com alguns estudos avaliando o número de núcleos positivos e sua intensidade (Boos et al., 1996; Dhaliwal et al., 2002), outros apenas a intensidade (Robinson et al., 2001) ou ainda apenas a contagem (Breeveld-Dwarkasing et al., 2002). Em nosso estudo optamos pela realização das duas avaliações.
A colheita seriada de biopsias endometriais por via transcervical parece não alterar a expressão dos receptores esteróides, uma vez que trabalhos que utilizaram esta técnica não consideraram esta variável para a interpretação dos resultados (Boos et al., 1996; Robinson et al., 2001). Neste estudo não foi detectado efeito da colheita seriada sobre a expressão dos receptores de estrógeno, contudo, a intensidade de marcação para os núcleos positivos para o receptor de progesterona no estroma uterino e epitélio glandular foi diferente entre os grupos avaliados, sendo superior no grupo D13. Neste, foram realizadas duas colheitas de fragmentos endometriais, seguidas de um episódio de estro e, posteriormente, outras três colheitas. Já no grupo D0, foram realizadas cinco colheitas consecutivas sem o episódio de estro entre elas, o que pode indicar que a colheita de fragmentos endometriais alterou a concentração de receptores de progesterona.
A diferente concentração de receptores hormonais ao longo do ciclo estral entre o epitélio glandular e estroma uterino foi também verificada por diversos autores (Boss et al., 1996; Vermeirsch et al., 1999; Xiao & Goff, 1999; Classen-Linke et al., 2000; Vermeirsch et al., 2000; Kimmins & MacLaren; 2001; Robinson et al., 2001; Breeveld-Dwarkasing et al., 2002; Sukjumlong et al., 2003).
De forma semelhante ao demonstrado em nosso estudo, outros autores relataram uma variação dos receptores de estrógeno e/ou progesterona ao longo do ciclo estral ou em conseqüência aos tratamentos com estrógeno e/ou progesterona (Kimball & Hansel, 1974; West et al., 1976; Koligian & Stormshak, 1977a; Henricks & Harris, 1978; Meyer et al., 1988; Vesanen et al., 1988; Schneider, 1989; Vesanen et al., 1991; Boos et al., 1996; Ing et al., 1996; De Cock et al., 1997; Tseng & Zhu, 1997; Vermeirsch et al., 1999; Xiao & Goff, 1999; Classen-Linke et al.,
2000; Vermeirsch et al., 2000; Kimmins & MacLaren, 2001; Robinson et al., 2001; Sukjumlong et al., 2003; Galabova-Kovacs et al., 2004). No presente estudo, embora não tenha sido observada uma variação para a contagem de receptores de progesterona, a intensidade de marcação variou, demonstrando a modificação da concentração desses receptores ao longo do ciclo estral.
Diversos estudos em bovinos (Henricks & Harris, 1978; Meyer et al., 1988; Vesanen et al., 1988; Schneider, 1989; Vesanen et al., 1991), utilizando técnicas onde não era possível a caracterização do tecido estudado, demonstraram que os receptores de estrógeno estavam em maiores concentrações nos momentos próximos ao estro e diminuídos durante a fase luteal média (entre os dias 9 e 15 do ciclo estral), semelhante ao que é relatado em ovinos por Koligian & Stormshak (1977a). Através de imunoistoquímica, onde é possível a caracterização do tipo celular estudado, foram encontrados resultados semelhantes para este receptor, com os autores divergindo apenas para o momento em que ocorre o decréscimo na fase luteal (Boos et al., 1996; Kimmins & MacLaren, 2001; Robinson et al., 2001). Nosso estudo também demonstra que os receptores de estrógeno nos dois tecidos estudados encontram-se em maiores concentrações durante o estro e em menores durante o diestro, principalmente entre os dias 13 e 19 do ciclo estral.
De forma contrária, Kimball & Hansel (1974) relataram em bovinos um significativo aumentou na concentração do receptor de estrógeno entre os dias 15 a 21 do ciclo estral quando comparada a obtida nos dias 2, 5 e 10.
Quanto ao receptor de progesterona, os estudos divergem em seus achados para o epitélio glandular, uma vez que alguns autores relatam que não ocorreu uma variação da imunomarcação ao longo do ciclo (Boos et al., 1996), outros demonstram uma imunoreatividade maior no início do ciclo estral, com uma queda durante toda a fase luteal (Kimmins & MacLaren, 2001) e outros ainda demonstram uma baixa expressão no estro, com um aumento na fase luteal inicial e ausentes na fase luteal tardia (Robinson et al., 2001). De forma geral, a concentração de receptores encontrada em nosso estudo são semelhantes aos de Robinson et al. (2001), uma vez