Prescriptive analysis of Sea-Hawk’s business model

O tingimento das fibras de algodão e a extração pelo suor sintético foram realizados na Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP- Ribeirão Preto, em colaboração com a pós- doutoranda Daniela Morais Leme. O processo de tingimento foi realizado de acordo com Neves et al [46], por dois métodos diferentes e com algumas modificações.

3.8.1. Tingimento com adição de álcali e sem ensaboamento

Inicialmente, pedaços de tecidos de algodão, com dimensões 3x6 cm2_{, foram pesados} para calcular o volume de água do banho de tingimento e as quantidades necessárias de corante, cloreto de sódio (NaCl) e carbonato de sódio (Na2CO3), que deveriam ser adicionados ao banho durante este processo. Para estes cálculos as seguintes relações foram adotadas:

- volume do banho: 1 kg fibra têxtil : 30 L de água

- massa corante: 2% do peso da fibra têxtil (288 mg para o tingimento com ensaboamento e 244 mg pra o sem ensaboamento)

- massa de NaCl: 70 g/L - massa de Na2CO3: 15 g/L

Em um recipiente de vidro disposto em banho-maria a 50°C, adicionou-se a água do banho de tingimento. Após a estabilização da temperatura a 50°C, o corante e o tecido têxtil foram adicionados com agitação suave e os demais reagentes foram posteriormente adicionados conforme o gráfico de tingimento ilustrado na Figura 7.

Figura 7. _{Etapas do processo de tingimento de fibra de algodão por corante reativo.}

22 Após a adição do Na2CO3 e ajuste do pH≥11, os tecidos foram mantidos no banho de tingimento por mais 40 minutos, sendo em seguida lavados em água fria corrente por 3 minutos.

3.8.2. Tingimento completo (com adição de álcali e ensaboamento)

Todas as etapas descritas acima foram igualmente realizadas para o tingimento completo. O que difere neste procedimento é a realização do ensaboamento após a lavagem do tecido em água corrente. Para isso, utilizou Resiwash AC® _{(Resinac, Jandira-SP), que é categorizado como} um sistema coloidal com alto sistema dispersante. Desta forma, após a realização do tingimento anteriormente descrito, os tecidos foram lavados por 5 minutos em água à 60ºC e colocados no banho de Resiwash AC® _{(0.6 g/L) por 15 minutos à temperatura de fervura. Decorrido este} tempo, os tecidos foram novamente lavados por 3 minutos em água a 60ºC e por mais 3 minutos em água fria corrente.

3.8.3. Extração do corante RG 19 pelas soluções de suor sintético

A lixiviação dos corantes das fibras de algodão tingidas foi realizada utilizando suor

sintético como extrator, segundo Meinke et al. [47].

Três diferentes soluções de suor sintético foram empregadas: solução de suor ácido (5,0g de cloreto de sódio; 0,5 de L-histidina monoclorada monohidratada; 2,2g de hidrogêneo fosfato de sódio; 1L de água destilada; pH 5,5); solução de suor alcalino (0,5g de L-histidina monoclorada monohidratada; 5,0g de cloreto de sódio; 5,0g hidrogênio ortofosfato de sódio; 1L de água destilada; pH 8,0); solução de suor neutro (5,0g de cloreto de sódio; 1,2g de ácido lático; 1,3g de uréia; 1L de água destilada; pH 6,5) [48]. Após o preparo, volumes das soluções de suor sintético, previamente calculados com base na proporção 1:50 (mg de tecido/mL de solução de suor), foram adicionados a recipientes de vidro dispostos em banhos-maria a 37°C e 42°C. Após a estabilização da temperatura, os tecidos tingidos foram colocados nos frascos contendo as diferentes soluções de suor sintético e amostras foram coletadas após 2, 8 e 12 horas do tempo inicial.

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3.8.4. Determinação dos possíveis produtos de degradaçãodo corante RG-19 por LC-MS/MS

Para a investigação da formação de possíveis subprodutos oriundos da degradação promovida pelas soluções de suor sintético, utilizaram-se análises em um sistema LC-MS/MS Q

Trap. O espectrômetro utilizado foi o mesmo descrito no item 3.5. As amostras foram diluídas

com solução 50:50 MeOH/H2O + 1 mmol L-1 _{NH4 OAc e filtradas em membrana 0,22 µm antes} da injeção no cromatógrafo. A fase estacionária utilizada foi uma coluna Agilent Eclipse XDB C18 (150 x 4,6 mm d.i.) 5 µm, a fase móvel ACN/H2O seguindo o gradiente mostrado na Tabela 3 e a vazão de 1,0 mL min-1_{. O volume de injeção foi de 20 µL e a temperatura do forno de} 40°C.

Tabela 3. Gradiente utilizado para a eluição do corante RG-19 e da amostra extraída pelo suor

sintético.

Tempo Total (min) H2O (%) ACN (%)

0,0 95,0 5,0 9,0 40,0 60,0 9,5 5,0 95,0 10,0 5,0 95,0 10,5 95,0 5,0 13,0 95,0 5,0

O espectrômetro utilizado foi do tipo ion trap linear (Applied Biosystems 3200 QTrap) equipado com um TurboIonSpray acoplado ao sistema de cromatografia líquida, sendo as condições experimentais descritas a seguir: temperatura da fonte de íons igual a 550 ºC, voltagem no TurbolonSpray de -4,5 kV no modo de ionização negativo, potencial de dessolvatação ajustado para -60 V e N2 ultra puro como gás de colisão. O potencial de entrada de -4,5 V e trapeamento em Q0 foi comum a todos os experimentos sendo a faixa de trabalho de 150 a 1500 Da.

3.8.5. O teste da pré-incubação da Salmonella/microssoma

A avaliação da mutagenecidade do corante RG-19 e das amostras extraídas pelo suor sintético foi realizada utilizando o teste de Ames padrão, com as linhagens TA98 (hisD3052,

rfa, Δbio, ΔuvrB, pKM101, detector por deslocamento do quadro de leitura) e T100 (hisG46, rfa,

24 e YG1042, que apresentam uma super produção de nitroredutase e o-acetiltransferase. O processo de pré-incubação é considerado mais seletivo na detecção de mutações que o método de incorporação da placa, uma vez que metabólicos mutagênicos de vida-curta têm uma maior chance de reagir com as cepas teste no pequeno volume da mistura de pré-incubação.

Os experimentos foram realizados utilizando cinco doses e em triplicata, na presença e na ausência do metabólito de ativação exógena S9 e utilizando 30 minutos de pré-incubação a 37°C. Para o corante comercial, a maioria dos experimentos foi realizada utilizando um intervalo de dosagem entre 5 e 5000 µg/placa. Para as amostras extraídas pelo suor, a maior dose testada baseou-se na maior concentração de corante encontrada pelas análises de CLAE-DAD. Foi utilizado como branco uma amostra de suor sem corante. Além disso, uma vez que a histidina presente no suor poderia ter influenciado o teste de mutagenicidade, este branco de solução de suor sintético foi preparado sem a adição deste aminoácido. Todos os resultados positivos foram confirmados através de um segundo experimento.

Em resumo, 100 µL de culturas de cada linhagem de S. typhimurium, cerca de 109 células/mL, 500 µL de tampão fosfato de sódio 0,2 mol L-1 _{ou mistura S9 e 100 µL do corante} foram incubados a 37°C por 30 minutos, sem agitação. Depois da incubação, 2 mL de agar foram adicionados e a mistura foi transferida para uma placa agar e estas placas foram, então, incubadas a 37°C por 66 horas. As colônias foram contadas manualmente. As amostras foram consideradas positivas quando significantes ANOVA e doses-resposta foram obtidos do modelo de Bernstein [41]. Os resultados foram expressos como a média do número de revertentes por placa ± desvio padrão.

O controle negativo para os experimentos realizados com os corantes comerciais foi tampão fosfato (PBS), e a amostra de suor foi utilizada como controle negativo para os experimentos utilizando amostras de suor depois da extração do corante. Os controles positivos para TA98 e TA100 foram 4-nitroquinolina-N-óxido (4-NQO, Sigma), em uma concentração de 5µg/placa, sem ativação metabólica, e 2-aminoantraceno (2-AA, Aldrich) em uma concentração de 25 µg/placa, com S9. Para YG1041 os controles positivos foram 4-nitro-o-fenilenediamina- 4NOP (100 µg/placa) e 2-aminoantraceno – 2AA (0,625 µg/placa), e para YG1042 foram 2- nitrofluoreno- 2NF (100 µg/placa) e 2-aminoantraceno- 2 AA (25 µg/placa).

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