Possible improvements

Com a evolução das tecnologias do DNA recombinante, o descobrimento de seqüência simples repetitivas no genoma de eucariotos e o desenvolvimento da PCR, a partir de meados da década de 90 foi iniciada a transição de tecnologia de verificação de parentesco em eqüinos, passando de tipagem sangüínea para a tipagem de marcadores moleculares baseados na variação observada em seqüências de DNA. O trabalho de Bowling et al. (1993a) é o pioneiro descrevendo, durante um congresso mundial de identificação humana, a introdução da tipagem de DNA para a verificação de parentesco em bovinos e eqüinos. Em seguida Binns et al. (1995) utilizaram uma bateria de 8 marcadores microssatélites em cavalos PSI. Eles analisaram oito casos de dupla cobertura, ou seja, com dois supostos garanhões, que não puderam ser resolvidos pela tipagem sangüínea e em cinco dos oito casos eles identificaram exclusões claras de paternidade. Eles concluem o trabalho afirmando que a análise de DNA é um adjunto útil à tipagem sangüínea e que, provavelmente no futuro, iria substituí- la. Hoje, 2007, a transição de tipagem sangüínea para tipagem de microssatélites ainda está de certa forma ocorrendo uma vez que muitos laboratórios e associações possuem um grande número de animais genotipados via tipagem sangüínea e ficam, portanto, resistentes a mudar de tecnologia e com isso ter que re-genotipar todos estes animais. Entretanto esta mudança tecnológica é irreversível principalmente devido à pressão do comércio mundial de animais com destaque para animais Puro Sangue Inglês, que vem demandando a verificação de parentesco pela análise de DNA.

Várias são as vantagens da análise de marcadores microssatélites. Com a análise de DNA, não são necessárias amostras de sangue fresco, bastando sangue imobilizado sobre papel filtro e sem necessidade de refrigeração. Alternativamente podem ainda ser usados bulbos capilares de pêlos de crina ou mesmo tecidos e ossos nos casos de animais falecidos. Além destas vantagens práticas, marcadores de DNA fornecem um poder mais elevado de discriminação individual e de exclusão de paternidade e maternidade mesmo em casos de forte consangüinidade. A análise de DNA permite ainda a utilização de um grande número de marcadores adicionais para solucionar casos complexos de verificação de parentesco nos casos das baterias padrão de marcadores não conseguirem fornecer um resultado conclusivo.

Baterias de marcadores microssatélites para eqüinos têm sido propostas e otimizadas em alguns sistemas multiplex nos últimos anos visando atender situações de dificuldade de discriminação com base em tipagem sangüínea principalmente em situações nas quais garanhões aparentados são testados frente a um mesmo produto na qualidade de supostos pais. Bowling et al. (1997) validaram uma bateria de 11 microssatélites que inclui os nove recomendados pela ISAG. Para avaliar esta bateria de marcadores, eles compararam o desempenho forense destes marcadores com 15 locos de grupos sangüíneos e polimorfismos protéicos em 4803 cavalos da raça Quarto de Milha que, embora endogâmica, apresenta um histórico de base genética mais ampla do que cavalos PSI. Eles relataram que os 26 locos juntamente apresentaram uma efetividade teórica de 99,999% na detecção de paternidade incorreta. Apesar de relativamente poucos locos, a tipagem de DNA foi mais efetiva que a tipagem sangüínea alcançando um PE de 99,9%.

Alguns trabalhos otimizaram baterias de marcadores microssatélites para a genotipagem de eqüinos em sistemas multiplex nos últimos anos. Marklund et al. (1994) otimizaram uma bateria de 8 marcadores microssatélites (HTG3, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 15) para a genotipagem de quatro raças de eqüinos em sistemas multiplex. O PE combinado estimado para esse conjunto de marcadores foi de 98%, 98%, 96% e 99%, para as raças Árabe, Standardbred, PSI e Swedish Halbred, respectivamente.

Tozaki et al. (2001a) propuseram uma nova bateria de microssatélites desenvolvida no Japão a partir de um amplo trabalho de desenvolvimento de novos microssatélites para eqüinos, batizados com o código TKY. Uma bateria de 15 marcadores TKY aplicada em 250 eqüinos não relacionados da raça PSI, forneceu um poder combinado de exclusão de 99,998%, significativamente superior à bateria hoje em utilização recomendada pela ISAG. Lee e Cho (2006) utilizaram uma bateria de 14 microssatélites que inclui os nove marcadores recomendados pela ISAG e mais 5 adicionais comumente utilizados internacionalmente (ASB17, ASB23, CA425, HMS1, LEX33), atingindo uma PE de 99,98% com base em uma amostra de 1285 cavalos PSI. Jakabová et al. (2002) avaliaram o poder individual e combinado de seis microssatélites (ASB2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, VHL20) em uma amostra de 352 cavalos PSI na República Eslovaca e estimaram um poder combinado de exclusão de 98,88%. Foi observado que com apenas cinco marcadores microssatélites com maior PE individual, foi alcançada uma probabilidade de exclusão combinada de 98,45%. Luis et al. (2002) utilizaram seis microssatélites (ASB2, HMS3, HMS7, HTG4, HTG10, e VHL20) em três raças portuguesas autóctones de cavalos alcançando um poder de exclusão combinado de 99,6%, 99,5% e 88,5% para as raças Lusitano, Garrano e Sorraia, respectivamente. Esta última raça é caracterizada por um histórico de forte endocruzamento.

Dimsoski (2003) otimizou uma bateria de 17 microssatélites que inclui os nove recomendados pela ISAG (VHL20, HTG4, AHT4, HMS7, HMS6, HMS3, AHT5, ASB2 e HTG10) e mais oito marcadores também freqüentemente usados (ASB17, LEX3, HMS1, CA425, HTG7, HTG6, HMS2 e ASB23), constituindo um kit comercializado pela Applied Biosystems. Embora este trabalho não especifique o poder de exclusão atingido pela bateria de marcadores, certamente deverá estar acima de 99,99%. Ribeiro et al. (2005) avaliaram o desempenho forense de uma bateria de 17 microssatélites (VHL20, HTG4, AHT4, HMS7, HTG6, HMS6, UCDEQ425, HTG7, HMS3, AHT39, UM011, AHT29, UM010, UCDEQ405 AHT5, ASB2 e HTG10) amplificados em três sistemas multiplex de PCR em duas raças eqüinas brasileiras, Crioulo e Campolina. O poder de exclusão de paternidade foi estimado em

99,9996 % para Crioulo e 99,9939% para Campolina o que confirmou o elevado poder de discriminação destes marcadores para testes de paternidade e maternidade com eficiência significativamente maior do que tipagem sangüínea.