4.3 Low level graphics
4.3.2 Images in Java 2D
As CNVs foram primeiramente escolhidas de acordo com a sua posição no genoma: cada CNV possuía anexa à sua região uma sequência gênica de um dos miRNAs relacionados ao CCR.
Os dados de Cq, juntamente com o controle RNAse P, foram interpretados no software Copycaller em triplicata utilizando o método comparativo do “cycle threshold”, no qual se assume que o calibrador está presente em duas cópias do gene controle.
Para a análise dos dados gerados, as CNVs interpretadas como em duas cópias (diploide) são consideradas o padrão (MONDRAGON, 2013). Se há um ou nenhum número de cópias, se considera que a amostra do indivíduo sofreu perda, e se há mais que dois números de cópias, é entendido que a amostra sofreu ganho. A tabela 7 mostra a frequência de números de cópias entre amostras normais, tumor e linfonodo.
Tabela 7: Frequência de CNVs em amostras normais, tumorais e linfonodais.
Tabela de frequência de CNVs
CNV-miRNA Normal Tumor Linfonodo
Diplóide Ganho Perda Diplóide Ganho Perda Diplóide Ganho Perda miR-570 17 (65,4%) 9(34,6%) - 8 (29,6%) 17(63,0%) 2 (7,4%) 12(41,4%) 13 (44,8) 4(13,8%) miR-16 19 (63,3%) 7(23,3%) 4(13,3%) 18(58,1%) 10(33.3%) 2 (6,7%) 23(79,3%) 4 (13,8%) 2 (6,9%) miR-338 19 (65,5%) 6(20,7%) 4(13,8%) 12(40,0%) 16(53,3%) 2 (6,7%) 16(55,2%) 10(34,5%) 3(10,3%) Let-7 24 (80,0%) 4(13,3%) 2 (6,7%) 16(53,3%) 13(43,3%) 1 (3,3%) 24(82,8%) 5 (17,2%) - miR-1 23 (76,7%) 3(10,0%) 4(13,3%) 12(40,0%) 18(60,0%) - 23(76,7%) 6 (20,0%) 1 (3,3%) miR-150 23 (79,3%) 2 (6,9%) 4(13,8%) 20(66,7%) 10(33,3%) - 22(75,9%) 6 (20,7%) 1 (3,4%) miR-183 24 (77,4%) 3 (9,7%) 3 (9,7%) 18 (60%) 12(40,0%) - 19(65,5%) 7 (24,1%) 3(10,3%) miR-650 24 (92,3%) 2 (7,7%) - 18(66,7%) 7 (25,9%) 2 (7,4%) 21(70,0%) 7 (23,3%) 2 (6,7%) miR-31 21 (72,4%) 5(17,2%) 2 (6,9%) 14(46,7%) 13(43,3%) 2 (6,7%) 20(69,0%) 8 (27,6%) 1 (3,4%) RNU-6B 23 (76,7%) 6(20,0%) 1 (3,3%) 23(76,7%) 5 (16,7%) 2 (6,7%) 25(83,3%) 3 (10,0%) 2 (6,7%)
Pode-se observar a partir dessa tabela que há diferenças de perdas e ganhos de número de cópias do tecido tumoral e linfonodal em relação ao tecido normal. Especialmente, o ganho de número de cópias foi mostrado com frequência nos tecidos (ressaltado em negrito e sublinhado), com exceção para a CNV-RNU6B, que não mostrou mudanças. Isso aponta para o fato de que genes inseridos nessas regiões podem estar gerando produtos diferencialmente expressos, inclusive os miRNAs relacionados.
O Teste de Wilcoxon demonstrou a relação entre as CNVs comparadas a suas amostras normais. Nesse tipo de teste, é verificado se as medidas de posição de duas amostras são ou não iguais, no caso em que elas sejam dependentes. Houve significância de diferença de número de cópias (p < 0,05) para a CNV-miR570 e a CNV-miR650T (tabela 8).
Tabela 8: Significância entre CNVs comparadas com CNV normal
Significância entre CNVs Tumor Sig. Linfonodo Sig. miR570 0,008 miR570 0,026 miR16 0,791 miR16 0,302 miR338 0,321 miR338 0,527 Let7 0,185 Let7 0,448 miR1 0,226 miR1 0,495 miR150 1 miR150 0,748 miR183 0,467 miR183 0,516 miR650 0,035 miR650 0,083 miR31 0,201 miR31 0,614 RNU6B 0,805 RNU6B 1
Uma análise por meio de bancos de dados de miRNA foi feita para se avaliar alvos preditos e a possível relação desses miRNAs com patologias. O miR-570 possui 764 e 1222 genes-alvo preditos (wichgenes e miRDB databases, respectivamente), e o miR-650 possui 270 genes-alvo preditos (miRDB) muitos desses genes relacionados com diversas patologias e manutenção da vida celular. Mesmo esses dois miRNAs e CNVs tendo sido validados com expressão e número de cópias diferenciais significantemente em relação aos tecidos normais, o responsável pelo fenótipo tumoral das células ainda pode acontecer devido a outros genes inseridos nas CNVs ou fora delas.
Vaishnavi et al. (2013) avaliaram a significância de alguns miRNAs inseridos em CNV. Dez CNV-miRNAs foram listadas como prediletas para o estudo (dentre elas a CNV- miR-570) e analisadas por meio de programas computacionais. Uma hipótese, como a do presente trabalho, foi que um miRNA inserido em uma CNV que sofreu aumento no
número de cópias tivesse também aumento de expressão, dessa forma alterando também a expressão gênica de todos os genes-alvo do miRNA. Esses autores também relataram que 35 genes-alvo exclusivos dos miRNAs que estavam em regiões deletadas mostraram aumento na sua quantificação e expressão, enquanto que 32 genes-alvo de miRNAs encontrados em regiões de CNV duplicadas mostraram expressão diminuída.
Baseado no estudo de Vaishnavi et al. (2013), se observa através dos dados da
tabela 7 e da tabela 8 que para o miR-570 na amostra linfonodal essa hipótese seria
válida, pois o tecido linfodonal apresentou perda em número de cópias de CNVs, e o miR- 570 foi reprimido. Porém, para a CNV-miR650, a CNV apresentou aumento no número de cópias, enquanto que o miR-650 foi subexpresso, indicando que essa hipótese não é válida para câncer colorretal, ou para todos os miRNAs e genes-alvo.
Até o presente momento não existem estudos que correlacionam estatisticamente a expressão diferencial de miRNAs com a variação do número de cópias. Isso evidencia a importância desse teste para se avaliar se eles são correlacionados.
Após verificar que não existem evidências consistentes a respeito da correlação entre miRNAs e CNVs nessas amostras de CCR, foram verificados outros pontos relacionados às CNVs, a fim de que se obtivesse relação da variação do número de cópias com características clínicas.
O teste de long Rank (Mantel Cox) foi feito para se avaliar a relação entre o número de cópias e a taxa de sobrevida (tabela 9). Esse é um teste não-paramétrico, que procura testar uma hipótese entre dois momentos, onde um é o observado e o outro é esperado (se espera que com a mudança na variação do número de cópias não haja aumento ou diminuição da taxa de sobrevida). Dessas variações de número de cópias, pôde-se observar que houve significância para a CNV-miR570T (p < 0,02).
Tabela 9: Correlação entre CNVs e sobrevida global (teste long rank-Mantel Cox)
Correlação entre CNVs e sobrevida global Normal Tumor Linfonodo
Sig. Sig. Sig. CNV-miR570 0,517 0,173 0,676 CNV-miR16 0,314 - 0,381 CNV-miR338 0,76 0,346 0,207 CNV-Let7 0,947 0,981 0,376 CNV-miR1 0,862 0,264 0,636 CNV-miR150 0,137 0,022 0,563 CNV-miR183 0,362 0,171 0,927 CNV-miR650 0,642 0,076 0,491 CNV-miR31 0,665 0,21 0,987 CNV-RNUU6B 0,201 0,985 0,644
A partir dessa informação, pode-se observar que indivíduos diploides (com 2 números de cópias) têm menor sobrevida, como pode ser visto na figura 18, que mostra o teste de Kaplan-meier, usado para avaliar sobrevida dividindo o tempo de seguimento em intervalos, nos quais a delimitação corresponde ao tempo em que ocorreu cada evento de óbito.
Figura 18: Sobrevida global em relação a número de cópias da CNV_miR-150N (Teste de Kaplan-Meier)
A fim de determinar a relação da variação do número de cópias com o risco de recorrência de câncer de cabeça e pescoço, Zhang et al. (2013) utilizaram 441 pacientes em uma análise estatística utilizando regressão de Cox e curvas de Kaplan-meier/long rank. Foi encontrado uma diminuição significativa da recorrência e sobrevida livre de doença em indivíduos com pelo menos duas cópias comparado com indivíduos que possuíam deleções da CNV que carregava GSTM1 (Glutationa S-transferase classe 1), evidenciando que diferenciar indivíduos com perfis de haplótipo é mais importante para determinação de sobrevida de câncer do que apenas detectar a presença ou ausência da molécula.
Em contrapartida, um estudo identificou uma CNV que quando duplicada aumenta a prevalência e mortalidade de câncer de próstata em indivíduos afro-americanos. A CNV em questão abriga o gene IGHG3, que apresentou superexpressão nos indivíduos com câncer. Para esse caso, o ganho no número de cópias foi fator predisponente de menor sobrevida global (LEDET et al., 2013).
Desta forma, os dados aqui demonstrados evidenciam que a CNV-miR150, quando diploide, está associada com menor sobrevida. Isso demonstra que cada CNV abriga genes de natureza variável, e que podem se comportar de maneiras diversas quando a dosagem gênica é alterada em uma amostra tumoral. Uma sugestão para experimentos futuros é avaliar quais genes se encontram inseridos dentro das CNVs, além dos miRNAs com seus genes-alvo.
O câncer colorretal tem importância epidemiológica mundialmente. As alterações moleculares que levam ao seu desenvolvimento são complexas, em grande número, e interagem entre si. Cada vez mais se faz necessário que se estude cada mecanismo molecular de forma mais profunda, mas também, paralelamente, é de grande importância que se enxergue o microambiente tumoral em maior escala, de modo que se visualize as interações que um mecanismo molecular provoca no outro.
5.2.4 Correlação de miRNA x CNVs
Uma correlação da expressão dos miRNAs com as recpectivas CNVs foi feita, na busca de encontrar alguma ligação entre o número de cópias e dosagem gênica, um dos principais objetivos deste trabalho. Fazendo correlação não-paramétrica entre as amostras de miRNA e CNV, houve significância entre o miR16T e a CNV-miR16T (tabela
10), ou seja, para essas amostras há correlação entre miRNAs e CNVs.
Tabela 10: Correlação entre expressão diferencial de miRNAs e CNVs (teste ANOVA)
Correlação entre miRNAs e CNVs Sig. CNVxmiR570T 0,286 CNVxmiR16T 0,045 CNVxmiR338T 0,595 CNVxmiRLet7T 0,286 CNVxmiR1T 0,467 CNVxmiR150T 0,985 CNVxmiR183T 0,924 CNVxmiR650T 0,892 CNVxmiR31T 0,197 CNVxRNU6BT 0,662
O resultado obtido onde a CNV-miR16T apresenta correlação representa apenas uma pequena parte que corrobora com a hipótese desse trabalho. O único resultado obtido significante estatisticamente comprova que os dados estão em border line, ou seja, são limítrofes. Para melhor entender os mecanismos genéticos e epigenéticos que interagem e influenciam entre si são muito diversos, e é necessário que hajam estudos mais aprofundados para que se tenha maior certeza que as CNVs podem influenciar os miRNAs, e logo seus mRNAs-alvo.
Cada CNV abriga uma variedade de genes que podem influenciar no fenótipo celular, e a interação desses genes e dos miRNAs com mRNAs-alvo têm caráter pleiotrópico, o que dificulta muito o entendimento desses mecanismos.
Stranger et al. (2007) mostraram que há diferença significativa na expressão gênica entre genes relacionados a CNVs duplicadas e deletadas, porém essa diferença é muito menor do que se espera. Isso se deve à falta de conhecimento do breakpoint de cada CNV. Dessa forma, um gene pode estar apenas parcialmente dentro de uma região de CNV, e quando duplicado, não há produção de um produto gênico funcional.
É importante ressaltar que poucos estudos são encontrados quando se procura associação entre CNVs e miRNAs no câncer ou em outras áreas biológicas. Isso evidencia a necessidade de que se prossigam com as pesquisas nessa linha, de modo que se entenda melhor a interação dos vários mecanismos e moléculas. Esta compreensão pode ser de grande importância futuramente para o desenvolvimento de medicações e medidas de detecção precoce que diminuam o número de indivíduos afetados de câncer mundialmente.
Existe também um viés relacionado às técnicas a serem realizadas para a análise de tecidos cancerosos: o tumor é naturalmente muito complexo e heterogêneo, logo as células dentro do próprio tumor podem variar em número de cópias e expressão gênica. Por isso é muito importante que se faça a estratificação das amostras a serem estudadas, de modo que elas se aproximem em nível molecular o máximo possível.
A proposta desse trabalho foi verificar se havia interação de miRNAs com relação à variação do número de cópias, e destes com características clínicas e fatores prognósticos. De forma geral, foi entendido que para esse evento as CNVs não influenciam na dosagem gênica dos miRNAs estudados, porém uma série de viés podem ter acontecido para que essa correlação não tenha ocorrido. Novos estudos com número maior de indivíduos poderiam contribuir para se ter um grau maior de certeza do fato, assim como uma classificação de indivíduos mais específica, como selecioná-los através de tipagem molecular, como tipo de mutação presente no tumor. Dessa forma, as amostras tumorais poderiam fazer parte de um grupo mais homogêneo, e facilitar o alcance estatístico para diversas interações, inclusive as interações dos mecanismos moleculares com os eventos clínicos.
O presente trabalho procurou relacionar algumas características e mecanismos moleculares, a fim de tornar mais claro como acontece a tumorigênese, de uma forma geral. O CCR, sendo uma patologia que causa importantes taxas de mortalidade a cada ano pelo mundo foi escolhido para o estudo, relacionando uma importante molécula de caráter epigenético, o miRNA, com a variação do número de cópias. Tanto os miRNAs quanto as CNVs ainda não são completamente compreendidos, devido ao pouco tempo em que vêm sendo estudados, e também pela complexidade dos vários mecanismos que interagem com eles. Esse trabalho reforçou que a expressão diferencial de miRNAs e a variação do número de cópias acontece no CCR, porém não chegou à conclusão de que os miRNAs sofrem diferença de expressão devido à variação do número de cópias. Adicionalmente, houve relação entre o genótipo diploide de variação de número de cópias para um CNV relacionado a menor sobrevida, sendo este um forte indicador de mau prognóstico. Os dados produzidos evidenciam a necessidade de se realizar mais testes com este foco, aprimorando os métodos utilizados.
6 CONCLUSÃO
Amostras de câncer colorretal foram utilizadas nessa pesquisa a fim de determinar se existia correlação entre a expressão diferencial de um grupo de miRNAs e a variação do número de cópias de regiões nas quais se encontravam suas sequências codificadoras, bem como avaliar se alguma característica de desfecho clínico também poderia ser afetada pelos miRNAs ou CNVs. A partir disso, pôde-se concluir com este trabalho que:
- Os miRNAs miR-338-3p, Let-7g, miR-1, miR-150, miR-183, miR-650 e miR-31 são diferencialmente expressos em CCR (todos reprimidos, com exceção do miR-183 e miR- 31 que foram superexpressos). Destes sete miRNAs, apenas o Let-7g, miR-650 e miR- 150 não corroboram com a literatura em relação ao caráter de expressão (reprimido ou superexpresso). Isso sugere que muitas vezes os miRNAs podem agir de maneiras diferentes dependendo do momento e tipo celular.
- A CNV-miR-570 e a CNV-miR-650 apresentaram significância na diferença de número de cópias dos tecidos tumorais e linfonodais em relação aos tecidos normais, significando que essas CNVs (ou genes inseridos nelas) podem ter importância no desenvolvimento da tumorigênese.
- Indivíduos com genótipo diploide da CNV-miR-150 possuem menor sobrevida em CCR. Isso indica que essa CNV pode carregar genes que influenciam no prognóstico da doença.
- Não há correlação entre a expressão diferencial de miRNAs e a variação do número de cópias em CCR neste grupo de indivíduos, já que houve significância estatística para apenas um tipo de miRNA-CNV. Com essa conclusão, não se pode negar que essa hipótese talvez aconteça, porém indica que para esses casos a CNV não teve relação com o aumento ou diminuição da expressão gênica.
Os mecanismos pelos quais acontece a tumorigênese interagem entre si de diversas formas. Não foi possível determinar se, de fato, o miRNA pode sofrer influência
de expressão em consequência da variação do número de cópias, porém isso não significa que esse evento não possa acontecer.
A menor sobrevida relacionada a indivíduos diploides da CNV-miR-150 foi um importante achado, e indica que existem vários fatores determinantes do fenótipo de um indivíduo que se relacionam com a variação do número de cópias. Isso abre questões para futuros experimentos a fim de entender com mais clareza os mecanismos envolvidos. Novos testes devem ser feitos como complemento aos estudos realizados, pois é de grande importância que se validem mais dados relacionados à hipótese em questão, que se compreendida mais profundamente, pode melhorar as formas de tratamento e prevenção do câncer colorretal.
Esse estudo, então, abre possibilidades para o aprofundamento e aprimoramento das técnicas de pesquisa utilizadas, de modo a entender melhor a interação das CNVs e miRNAs no desenvolvimento do câncer.
REFERÊNCIAS
AL-TASSAN, N. et al. Inherited variants of MYH associated with somatic G:C-->T:A mutations in colorectal tumors. Nat Genet, v.30, n.2, p.227-32, Feb, 2002.
ALMAL, S. H.; PADH, H. Implications of gene copy-number variation in health and diseases. J Hum Genet, v.57, n.1, p.6-13, Jan, 2012.
AN, J. et al. MiR-23a in Amplified 19p13.13 Loci Targets Metallothionein 2A and Promotes Growth in Gastric Cancer Cells. J Cell Biochem, Apr 4, 2013.
ANGSTADT, A. Y. et al. The effect of copy number variation in the phase II detoxification genes UGT2B17 and UGT2B28 on colorectal cancer risk. Cancer, Apr 10, 2013.
ARMAGHANY, T. et al. Genetic alterations in colorectal cancer. Gastrointest Cancer Res, v.5, n.1, p.19-27, Jan, 2012.
ARMSTRONG, N. J. et al. Maternal Wnt/beta-Catenin Signaling Coactivates Transcription through NF-kappaB Binding Sites during Xenopus Axis Formation. PLoS One, v.7, n.5, p.e36136, 2012.
ATKIN, W. S. et al. Once-only flexible sigmoidoscopy screening in prevention of colorectal cancer: a multicentre randomised controlled trial. Lancet, v.375, n.9726, p.1624-33, May 8, 2010.
BANDRES, E. et al. Identification by Real-time PCR of 13 mature microRNAs differentially expressed in colorectal cancer and non-tumoral tissues. Mol Cancer, v.5, p.29, 2006.
BOVELL, L. C. et al. The Prognostic Value of microRNAs Varies with Patient Race/Ethnicity and Stage of Colorectal Cancer. Clin Cancer Res, May 29, 2013.
BREHENY, P. et al. Genetic association studies of copy-number variation: should assignment of copy number States precede testing? PLoS One, v.7, n.4, p.e34262, 2012.
BUECHER, B.; DE PAUW, A. [Hereditary colorectal cancer.]. Rev Med Interne, Feb 29, 2012.
CALIN, G. A. et al. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc Natl Acad Sci U S A, v.101, n.9, p.2999-3004, Mar 2, 2004.
CALVA, D.; HOWE, J. R. Hamartomatous polyposis syndromes. Surg Clin North Am, v.88, n.4, p.779-817, vii, Aug, 2008.
CARTHEW, R. W.; SONTHEIMER, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell, v.136, n.4, p.642-55, Feb 20, 2009.
CHANDHANAYINGYONG, C. et al. MAPK/ERK Signaling in Osteosarcomas, Ewing Sarcomas and Chondrosarcomas: Therapeutic Implications and Future Directions. Sarcoma, v.2012, p.404810, 2012.
CHEN, H. M.; FANG, J. Y. Genetics of the hamartomatous polyposis syndromes: a molecular review. Int J Colorectal Dis, v.24, n.8, p.865-74, Aug, 2009.
CHEN, W. et al. Identification of chromosomal copy number variations and novel candidate loci in hereditary nonpolyposis colorectal cancer with mismatch repair proficiency. Genomics, Feb 20, 2013.
COLAS, C. et al. Lynch or Not Lynch? Is that Always a Question? Adv Cancer Res, v.113, p.121- 66, 2012.
COURTNEY, R. J. et al. Colorectal cancer risk assessment and screening recommendation: A community survey of healthcare providers' practice from a patient perspective. BMC Fam Pract, v.13, n.1, p.17, Mar 14, 2012.
CRUK, C. R. U. Bowel cancer - survival statistics. 2009. Disponível em:
http://info.cancerresearchuk.org/cancerstats/types/bowel/survival/#stage;. Acesso em: 13 jun. 2013.
DHAWAN, D.; PADH, H. Pharmacogenetics: technologies to detect copy number variations. Curr Opin Mol Ther, v.11, n.6, p.670-80, Dec, 2009.
DI FIORE, R. et al. Genetic and molecular characterization of the human osteosarcoma 3AB-OS cancer stem cell line: a possible model for studying osteosarcoma origin and stemness. J Cell Physiol, v.228, n.6, p.1189-201, Jun, 2013.
DIOSDADO, B. et al. MiR-17-92 cluster is associated with 13q gain and c-myc expression during colorectal adenoma to adenocarcinoma progression. Br J Cancer, v.101, n.4, p.707-14, Aug 18, 2009.
EARLE, J. S. et al. Association of microRNA expression with microsatellite instability status in colorectal adenocarcinoma. J Mol Diagn, v.12, n.4, p.433-40, Jul, 2010.
EISENMANN, D. M. Wnt signaling. WormBook, p.1-17, 2005.
FABER, C.;KIRCHNER, T.; HLUBEK, F. The impact of microRNAs on colorectal cancer. Virchows Arch, v.454, n.4, p.359-67, Apr, 2009.
FANCIULLI, M.;PETRETTO, E.; AITMAN, T. J. Gene copy number variation and common human disease. Clin Genet, v.77, n.3, p.201-13, Mar, 2010.
FENG, L. et al. Down-regulation of NDRG2 gene expression in human colorectal cancer involves promoter methylation and microRNA-650. Biochem Biophys Res Commun, v.406, n.4, p.534-8, Mar 25, 2011.
FERLAY, J. et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer, v.127, n.12, p.2893-917, Dec 15, 2010.
FEUK, L.;CARSON, A. R.; SCHERER, S. W. Structural variation in the human genome. Nat Rev Genet, v.7, n.2, p.85-97, Feb, 2006.
FILIPOWICZ, W. et al. Post-transcriptional gene silencing by siRNAs and miRNAs. Curr Opin Struct Biol, v.15, n.3, p.331-41, Jun, 2005.
FOULKES, W. D. p53--master and commander. N Engl J Med, v.357, n.25, p.2539-41, Dec 20, 2007.
FREEMAN, J. L. et al. Copy number variation: new insights in genome diversity. Genome Res, v.16, n.8, p.949-61, Aug, 2006.
FU, L. et al. Mismatch repair gene mutation analysis and colonoscopy surveillance in Chinese lynch syndrome families. Cell Oncol (Dordr), May 3, 2013.
GAEDCKE, J. et al. The rectal cancer microRNAome--microRNA expression in rectal cancer and matched normal mucosa. Clin Cancer Res, v.18, n.18, p.4919-30, Sep 15, 2012.
GARCIA-ORTI, L. et al. Integration of SNP and mRNA arrays with microRNA profiling reveals that MiR-370 is upregulated and targets NF1 in acute myeloid leukemia. PLoS One, v.7, n.10,
p.e47717, 2012.
GLOBOCAN. Colorectal Cancer Incidence and Mortality Worldwide in 2008. Cancer Fact Sheet, 2008.
HALFORD, S. E. et al. Germline mutations but not somatic changes at the MYH locus contribute to the pathogenesis of unselected colorectal cancers. Am J Pathol, v.162, n.5, p.1545-8, May, 2003.
HAMFJORD, J. et al. Differential expression of miRNAs in colorectal cancer: comparison of paired tumor tissue and adjacent normal mucosa using high-throughput sequencing. PLoS One, v.7, n.4, p.e34150, 2012.
IAFRATE, A. J. et al. Detection of large-scale variation in the human genome. Nat Genet, v.36, n.9, p.949-51, Sep, 2004.
Instituto Nacional do Câncer (INCA). Incidência de câncer no Brasil, 2012. Disponível em:
http://www.inca.gov.br/estimativa/2012/tabelaestados.asp?UF=BR. Acesso em: 10 jun. 2013.
INOUE, T. et al. Clinicopathological and prognostic significance of microRNA-107 and its
relationship to DICER1 mRNA expression in gastric cancer. Oncol Rep, v.27, n.6, p.1759-64, Jun, 2012.
INUI, M.;MARTELLO, G.; PICCOLO, S. MicroRNA control of signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol, v.11, n.4, p.252-63, Apr, 2010.
JAFARI, N. et al. Expression levels of microRNA machinery components Drosha, Dicer and DGCR8 in human (AGS, HepG2, and KEYSE-30) cancer cell lines. Int J Clin Exp Med, v.6, n.4, p.269-74, 2013.
JASS, J. R. Colorectal polyposes: from phenotype to diagnosis. Pathol Res Pract, v.204, n.7, p.431-47, 2008.
KANAAN, Z. et al. Differential microRNA expression tracks neoplastic progression in inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer. Hum Mutat, Jan 12, 2012.
KHALAF, R. et al. Colorectal Cancer in a Monoallelic MYH Mutation Carrier. J Gastrointest Surg, Apr 27, 2013.
KIM, H. J.; BAR-SAGI, D. Modulation of signalling by Sprouty: a developing story. Nat Rev Mol