Por fim, foi analisada as atividades dos diferentes biocatalisadores TLL em diferentes meios de hidrólise (Tabela 5.4). Três substratos diferentes foram utilizados em três valores de pH diferentes: ésteres formados por um ácido alifático (hexanoato de etila), um aromático (fenilacetato) ou um aromático e um quiral (ácido mandélico). Diferenças no protocolo de imobilização da lipase, que podem produzir distorções ou endurecimento de áreas diferentes da proteína, pode ser uma ferramenta poderosa para sintonizar as
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propriedades de lipase. Assim, as atividades específicas de TLL imobilizadas em diferentes suportes foram analisadas.
Usando mandelato de metila, a atividade máxima foi encontrada em pH 8,5 para todas as preparações e os três valores de pH analisados (este ajuste com os resultados obtidos utilizando p-NPB, Figura 5.3). Com mandelato de metila a pH 5, o derivado mais ativo é a preparação onde a enzima foi imobilizada a pH 5 e, em seguida, bloqueadas (a incubação em pH alcalino reduz ligeiramente a atividade), com octil-TLL a preparação é menos ativa (em oposição aos resultados obtidos utilizando p-NPB). Isto não ocorreu com as outras duas preparações, onde a incubação por um longo prazo em pH alcalino aumentou a atividade. Agora, a enzima imobilizada a pH 7 é mais ativa do que a enzima imobilizada a pH 10. A pH 7, as atividades diminuem em todos os casos, mas as posições relativas são mais ou menos mantidas. Talvez haja um menor efeito da incubação alcalina das preparações. A pH 8,5 (do meio reacional), a atividade da enzima sofre um aumento drástico, sendo a enzima imobilizada a pH 5 a mais ativa. A diminuição da atividade da enzima imobilizada a pH 5, após incubação alcalina é agora mais significativa (281 U/mg -176 U/mg), a pH 7, a alteração é muito pequena (71 U/mg -70 U/mg) e no pH de 10, houve uma melhoria significativa (a partir de 109 U/mg -138 U/mg), as diferenças com a atividade utilizando octil-TLL são ampliadas em pH 8,5, a atividade é apenas 31 U/mg (7 vezes menor do que a preparação mais ativa).
Utilizando o fenilacetato de metila, as atividades diminuíram em comparação com o mandelato de metila. Com este substrato o derivado mais ativo continou sendo a preparação com a enzima imobilizada em pH 5, e bloqueada depois da imobilização, quando a atividade foi medida em pH 7 e 8,5. O longo tempo de incubação do derivado apresentou um efeito positivo, quando a atividade foi medida em pH 5. A incubação em longo prazo tem efeitos diferentes dependendo do pH de imobilização e do pH de determinação da atividade. Para a enzima imobilizada, a pH 7 ou pH 10, a atividade diminuiu após a incubação alcalina a pH 5, mas melhorou quando medida a pH 7 ou 8,5. O pH em que a atividade máxima de cada derivado é encontrada difere em cada caso. A máxima a pH 5 é encontrada para a preparações DVS pH 5 + pH 10 (72 h), pH 7 e pH 10 (24 h). A preparação mais ativa com esse substrato foi com a enzima imobilizada em octil e em DVS a pH 10 e incubado por 72h, quando o pH de medida foi de 8,5. Assim como, quando a atividade foi medida em presença de pH 7, os derivados mais ativos foram com a enzima imobilizada em pH 5 e pH 7 + pH 10 (72h),
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apresentaram alta atividade. As alterações do desempenho da enzima com o protocolo de imobilização, neste caso, são muito mais evidentes do que usando o substrato anterior.
Usando hexanoato de etila, a atividade é muito maior do que com o substrato anterior. Com este substrato, o biocatalisador octil-TLL é mais ativo em todos os valores de pH avaliados. Entre as preparações DVS-TLL, a preparação mais ativa foi com o derivado preparado pela imobilização da enzima em pH 7 e incubado a pH 10 por 72h (pH 7 + 10 pH (72 h)) a pH 5 e 7, enquanto que a pH 8,5 a atividade mais elevada foi encontrada utilizando o derivado pH 5 + pH 10 (72 h). A incubação por longo prazo em pH alcalino tem efeitos positivos em certos casos, e negativos em outros. A enzima imobilizada a pH 5 sempre tem a atividade melhorada (isto não aconteceu com o substrato anterior), a enzima imobilizada a pH 7 melhorou a atividade a pH 5 e 7 (uma forma muito significativa), mas diminuiu a pH 8,5, enquanto que a enzima imobilizada a pH 10 diminuiu a atividade em todos os valores de pH após a incubação por longo prazo. Todos as preparações DVS-TLL apresentaram a maior atividade em pH 5. A maioria tem um mínimo em pH 7, exceto pH 5 e pH 7 + pH 10 (72 h). Por outro lado, octil-TLL tem uma atividade muito semelhante a pH 5 e 7, com uma queda no pH 8,5.
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Tabela 5.4. Atividade de diferentes preparações TLL contra diferentes substratos em diferentes condições. Os detalhes experimentais podem ser encontradas na Seção 5.3. MM, mandelato de metila; MPA, fenilacetato de metila; EH, hexanoato de etila. A atividade é dada em µmoles de substrato hidrolisado por minuto e mg de enzima imobilizada. *Atividade (x102).
Fonte: Elaborada pelo autor.
Preparações de TLL *MM/ pH5 *MM/ pH7 *MM/ pH8.5 *MPA/ pH5 *MPA/ pH7 *MPA/ pH8.5 EH/ pH5 EH/ pH7 EH/ pH8.5 DVS-pH5 48,05 ± 4,3 40,02 ± 0,3 281,08 ± 2,5 1,29 ± 0,12 1,57 ± 0,1 1,28 ± 0,1 5,59 ± 0,5 3,26 ± 0,3 2,99 ± 0,3 DVS-pH5-pH10 42,88 ± 3,8 38,61 ± 3,5 176,58 ± 1,6 1,96 ± 0,17 0,29 ± 0,03 0,82 ± 0,07 11,09 ± 0,9 3,31 ± 0,3 6,37 ± 0,6 DVS-pH7 19,77 ± 1,7 17,77 ± 1,6 71,64 ± 6,4 0,64 ± 0,06 0,13 ± 0,1 0,3 ± 0,03 3,78 ± 0,3 1,72 ± 0,2 3,06 ± 0,3 DVS-pH7-pH10 25,41 ± 2,3 17,55 ± 1,6 70,65 ± 6,4 0,48 ± 0,04 0,91 ± 0,1 0,46 ± 0,04 28,16 ± 2,5 9,59 ± 0,9 2,31 ± 0,2 DVS-pH10 15,01 ± 1,3 13,08 ± 1,2 109,33 ± 9,8 0,63 ± 0,06 0,15± 0,01 0,48 ± 0,04 7,91 ± 0,7 2,11 ± 0,9 2,26 ± 0,2 DVS-pH10-pH10 19,11 ± 1,7 16,37 ± 1,5 138,33 ± 12,5 0,35 ± 0,03 0,31 ± 0,01 0,62 ± 0,06 6,01 ± 0,5 0,92 ± 0,1 1,38 ± 0,1 Octil 15,11 ± 1,4 10,42 ± 0,9 31,33 ± 2,8 0,44 ± 0,48 0,52 ± 0,05 0,64 ± 0,05 72,64 ± 6,5 75,09 ± 6,7 42,65 ± 3,8
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5.5 Conclusão
Agarose ativada com DVS pode ser um suporte promissor para a imobilização de enzimas. A reação enzima-suporte muito forte pode, em certos casos, conduzir à inativação da enzima. Assim, algumas das lipases utilizadas reduziram sua atividade contra p-NPB de uma forma drástica, mas os resultados usando TLL são muito positivos.
A imobilização de TLL pode ser efetuada em diferentes valores de pH, e a posterior incubação a pH 10 durante 72 h permitiu melhorar a estabilidade da enzima. O efeito sobre a atividade da enzima desta incubação alcalina a longo prazo, tanto por ser negativo, apresentado em certos casos, quanto muito positivo (mas não em todos os casos).
Os diferentes protocolos de imobilização em suportes ativado com DVS possuem uma influência dramática nas características catalíticas da enzima: a atividade da enzima, a estabilidade e especificidade são fortemente moduladas, e também a influência do pH sobre as propriedades finais da enzima. Isto é conseguido apenas alterando o valor do pH na primeira etapa de imobilização da enzima em esferas de DVS-agarose, sugerindo a imobilização da enzima com diferentes orientações sobre o suporte, principalmente quando se compara as preparações incubadas por um longo prazo em pH alcalino, em que as possibilidades de ligação covalente multipontual entre a enzima e suporte devem ser quase idênticas. Isto é ainda mais fácil do que a utilização de glutaraldeído para a obtenção de preparações de lipase com diferentes propriedades (BARBOSA et al., 2012).
Por outro lado, os resultados indicam que é muito difícil prever o efeito do protocolo de imobilização sobre um substrato com base nos resultados com outros substratos. Isso também ocorreu em outros casos, como nas lipases imobilizadas em suporte estireno- divinilbenzeno via ativação interfacial (GARCIA-GALAN et al., 2014a), quando após a imobilização a atividade contra p-NPB quase desapareceu, sugerindo que as preparações de RML, Lecitase e PFL devem ser avaliadas contra os substratos verdadeiros antes de descartá- las definitivamente.
Assim, suportes ativados com DVS parece ser uma boa fonte de diversidade na elaboração de uma biblioteca de biocatalisadores imobilizados para aplicação em um processo em particular com boas perspectivas de sucesso (RODRIGUES et al., 2013).
Versatilidade do suporte ativado com divinilsulfona para o melhoramento das propriedades de CALB durante sua imobilização