A Figura 8.3 mostra o perfil de atividade das preparações de octil- e CNBr- Lecitase em função do pH. Os perfis são muito diferentes. Embora a enzima imobilizada covalentemente apresente claramente um ótimo de atividade a pH 6 e retenha apenas cerca de
Desenvolvimento de estratégias para modulação de propriedades de enzimas por técnicas físico-químicas visando à otimização de biocatalisadores
40% de atividade a pH 10, o derivado octil-Lecitase não tem um valor de pH ótimo claro no intervalo estudado, atividade em um plano a partir de pH 8-10, com uma certa tendência para aumentar a atividade até ao valor de pH mais elevado analisado (valores de pH mais elevados apresentavam uma hidrólise química muito rápida do substrato pNPB, o que inviabiliza a correta interpretação dos dados).
Considerando que o derivado octil-Lecitase já está estabilizado, coma forma aberta da enzima, a importância do valor de pH com o derivado de CNBr pode ser uma explicação provável para estes resultados muito diferentes. Em relação ao efeito das modificações químicas em que este perfil, é muito diversificado.
Primeiro, vamos concentrar-nos sobre os derivados com octil (Figura 8.3B). A aminação promoveu pouca modificação, uma vez que o perfil permaneceu inalterado. Isso foi muito surpreendente, considerando a mudança radical das interações iônicas comparando a enzima modificada e não modificada, e a mudança dramática que esta modificação química deve produzir sobre a forma como o pH pode afetar essas interações.
A modificação com TNBS ocasionou a diminuição da atividade a valores de pH inferiores a 8 e o efeito é mais significativo a valores de pH ácido (a pH 5 os derivados de octil modificados com TNBS mantiveram apenas 15% da atividade, enquanto o derivado não modificado manteve 61%). A modificação com glutaraldeído produziu um perfil de atividade /pH mais estreito, com uma atividade máxima em pH 8, com uma redução mais significativa da atividade, tanto em valores ácido como em básicos de pH.
A aminação da preparação TNBS-Lecitase promoveu certa recuperação da atividade a valor de pH ácido (cerca de 50 % de retenção da atividade a pH 5). No entanto, o efeito da aminação é claramente negativo para a atividade da preparação modificada com glutaraldeído em valor de pH ácido (ocorre diminuição na atividade de 50% a 15% , a pH 5). Nota-se ainda queo pH ótimo da preparação com glutaraldeído muda de 8 a 9.
A modificação com TNBS da enzima aminada tem quase nenhum efeito sobre o perfil de atividade /pH . E a modificação com glutaraldeído da enzima aminada tem um efeito sobre o perfil atividade /pH semelhante a modificação da preparação octil não modificada, mas deixando um valor de pH ótimo claro a pH 9.
Desenvolvimento de estratégias para modulação de propriedades de enzimas por técnicas físico-químicas visando à otimização de biocatalisadores
Figura 8.3 - Efeito do pH sobre a atividade frente a pNPB das diferentes preparações de Lecitase. Experimentos foram realizados conforme descrito na Seção 2 (A) Efeito do protocolo de imobilização: octil-Lecitase:. Quadrados; CNBr-Lecitase: triângulos. (B) (octil-Lecitase) e (C), (CNBr-Lecitase). Efeito da modificação química. Uma modificação: linhas pretas sólidas. Quadrados: Nenhuma modificação; Triângulos: EDA, Círculos: TNBS, losango: GLUTA. Modificação da Lecitase aminada: linhas cinza sólidos. Circulo cinza: TNBS, Circulo: GLUTA. Aminação de Lecitase modificada: linhas cinza tracejada. Losango cinza: TNBS, Cruz Cinzenta: GLUTA.
Fonte: Elaborada pelo autor.
A Figura 8.3C mostra o efeito das modificações sobre o pH /atividade de Lecitase imobilizada sobre CNBr. Neste caso, as alterações são muito mais evidentes do que quando se utiliza octil-Lecitase. A aminação fez com que a atividade máxima fosse observada no valor mais elevado de pH estudado, o pH 10. Sob estas condições, a atividade absoluta da enzima modificada foi 6 vezes maior do que a da enzima não modificada (0,5 contra 3 U/mg de enzima). No entanto, no pH de 5, a modificação reduziu a atividade da enzima em cerca de um fator de 2 vezes .
A modificação com TNBS provocou uma variação no valor ótimo de pH, de 6 a pH 9 (a este valor de pH da modificação aumentou 8 vezes a atividade enzimática, entre 0,5 e 4 U/ mg). Na faixa de pH ácido, esta diferença é mais curta (por exemplo, a um pH de 5 foi de 0,8 a 1,3). A modificação com glutaraldeído produziu um ligeiro desvio do valor de pH
Desenvolvimento de estratégias para modulação de propriedades de enzimas por técnicas físico-químicas visando à otimização de biocatalisadores
ótimo (até pH 7), com redução muito significativa da atividade nos valores de pH alcalinos (pH 10 a atividade diminuiu após a modificação de 0,5 a 0,08).
A aminação da enzima modificada com TNBS deslocou para pH 10 a máxima a atividade. Neste valor de pH, a aminação produziu um incremento da atividade da enzima (de 2,1 a 2,6 U/mg), que é cinco vezes maior do que a da enzima não modificada (0,5 U / mg). No entanto, a pHs ácidos, o efeito é muito negativo, a pH 5, por exemplo, a atividade foi de 1,3 a 0,06, mais baixa do que a da enzima apenas aminada (0,8 U/mg). A aminação da Lecitase modificada com glutaraldeído não tem um claro efeito sobre o perfil de atividade em função do pH, apenas um melhor desempenho em valores de pH alcalino (na verdade, as atividades tornam-se idênticas a pH 10).
O tratamento da enzima aminada com TNBS não afetou o valor de pH ótimo; mas a atividade diminuiu em valores de pH mais alcalinos ou ácidos, resultando em uma curva estreita. Usando glutaraldeído na enzima aminada,o perfil de atividade/ em função do pH permaneceu quase inalterado.
Os resultados obtidos mostram como o efeito de uma modificação química é fortemente dependente do valor de pH, algumas modificações positivas a um valor de pH, podem se tornar muito negativas em outro. O efeito do pH sobre a atividade da enzima depende da estratégia empregada na imobilização; algumas explicações prováveis foram detalhadas anteriormente.