Overskridelse gjennom kjærlighet

Para além das metodologias já existentes nos laboratórios onde este trabalho foi desenvolvido, de modo a cumprir os objectivos específicos estabelecidos foi necessário, à priori, proceder a um

desenvolvimento experimental de implementação/aferição de algumas metodologias assim como à preparação de material biológico.

Assim, de modo a conseguir cumprir o primeiro objectivo específico, e pelo facto de estarmos, no início deste trabalho, perante a emergência de uma nova variante de vírus influenza pouco conhecida, foi necessário proceder a um estudo genético e evolutivo das estirpes de vírus influenza da nova variante pandémica A(H1N1)pdm09 que circularam em Portugal no início da pandemia de 2009. Para este estudo foi necessário proceder à:

- Implementação de uma estratégia de sequenciação do genoma da nova variante pandémica de vírus influenza A(H1N1)pdm09;

- Sequenciação e estudo evolutivo das proteínas antigénicas de superfície HA e NA e da proteína não estrutural NS1 dos vírus influenza da nova variante pandémica que circularam em Portugal no início da pandemia;

- Sequenciação do genoma completo dos vírus influenza da nova variante pandémica para analisar a variabilidade genética das estirpes nacionais e seleccionar uma estirpe representativa da variante A(H1N1)pdm09.

Para os segundo e terceiro objectivos específicos foi necessário garantir um volume suficiente, para todos os ensaios, de vírus com uma concentração conhecida, de modo a ser possível o estudo da apoptose em células infectadas com a mesma dose infecciosa entre cada vírus. Para tal, foi necessário:

- Constituir stocks virais das estirpes representativas da variante A(H1N1)pdm09 e do tipo B seleccionadas para este trabalho

- Implementar e aferir uma técnica de titulação de vírus influenza do tipo A e do tipo B que permita titular os stocks virais constituídos;

A determinação dos componentes virais, muito em particular os factores genéticos, que induzem as diferenças na apoptose na infecção pelos diferentes tipos de vírus influenza, foi estudada através do efeito da transfecção de células com cada um dos segmentos virais clonados em plasmídeo de expressão. Para obter estes plasmídeos foi necessário:

- Implementar e aferir uma técnica de clonagem dos segmentos genéticos de vírus influenza em plasmídeos de expressão bidireccionais;

- construir uma biblioteca de genes com clones de todos os segmentos genéticos do vírus influenza do tipo A e do tipo B em plasmídeos de expressão bidireccional.

Figura 8 – Diagrama resumo do objectivo geral e dos objectivos específicos estipulados para este

trabalho e do desenvolvimento experimental necessário de implementar/aferir para o cumprimento de dos objectivos estipulados.

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Diferenças na indução da apoptose em infecções pelos principais tipos de

vírus influenza que infectam o Homem

Selecção estirpes representativas da nova

variante pandémica A(H1N1)pdm09 e dos vírus

influenza do tipo B

Estudo genético e evolutivo das estirpes de vírus influenza da nova variante pandémica A(H1N1)pdm09 que circularam em Portugal

no início da pandemia de 2009:

- Implementação de uma estratégia de sequenciação do genoma da variante pandémica

A(H1N1)pdm09; - Estudo evolutivo das proteínas HA, NA e NS1 dos

vírus da nova variante pandémica; - Sequenciação e análise do genoma completo, das estirpes

nacionais da nova variante pandémica, para analisar a variabilidade genética

Avaliação das diferenças cinéticas na indução da apoptose na infecção por vírus influenza do tipo A e do

tipo B

Constituição de stocks virais das estirpes representativas

seleccionadas

Implementação e aferição de uma técnica de titulação de vírus

influenza do tipo A e do tipo B para titular os stocks virais

Análise comparativa das diferenças na resposta celular em infecções pelos diferentes

tipos de vírus influenza

Determinação dos componentes virais que induzem as diferenças na apoptose na infecção pelos

diferentes tipos de vírus influenza

Implementação e aferição de uma técnica de clonagem dos segmentos genéticos de vírus influenza em plasmídeos de

expressão bidireccionais

Construção de uma biblioteca de genes com clones de todos os segmentos genéticos do vírus influenza do tipo A e do tipo B em plasmídeos de expressão

bidireccional

3 Caracterização genética dos vírus

A(H1N1)pdm09 circulantes em Portugal

Os resultados presentes neste capítulo contribuíram para as seguintes publicações:

- Giria MT, Rebelo de Andrade H, Santos LA, Correia VM, Pedro SV, Santos MA. Genomic

signatures and antiviral drug susceptibility profile of A(H1N1)pdm09. J Clin Virol, 2012. 53: 140-144;

- Santos LA, Correia V, Giria M, Pedro S, Santos MM, Silvestre MJ, Rebelo-de-Andrade H. Genetic

and antiviral drug susceptibility profiles of pandemic A(H1N1)v influenza virus circulating in Portugal.

Influenza Other Respir Viruses, 2011. 5 (Suppl. 1), 294–300;

- Santos LA, Correia V, Pedro S, Alverca E, Santos MM, Silvestre MJ, Rebelo-de-Andrade H.

Caracterização genética da nova variante pandémica do vírus influenza A(H1N1) 2009 em circulação em Portugal: resultados preliminares. Revista Portuguesa de Doenças Infecciosas, 2010. 6(1): 7-13;

O material biológico utilizado neste capítulo foram estirpes de vírus influenza A(H1N1)pdm09 isoladas no Laboratório de Resistência aos Antivirais do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge pela Dra. Vanessa Correia a partir de amostras clínicas com diagnóstico molecular positivo para vírus influenza A(H1N1)pdm09 gentilmente cedidas pelas Doutora Maria José Silvestre e Doutora Maria Madalena Almeida Santos do Serviço de Patologia Clínica do Centro Hospitalar Lisboa Centro - Hospital Curry Cabral.

A maioria da metodologia descrita neste capítulo foi executada pelo autor da tese, Luis André Santos, tendo a Doutora Marta Gíria e a Dra. Vanessa Correia auxiliado na sequenciação do genoma de algumas das estirpes estudadas.