Oslo

3.7.1. Preparo das soluções de perfusão

As soluções empregadas na perfusão das câmaras de Üssing tem por base uma solução de Ringer para mamíferos, idealizada segundo a formulação preconizada por Field e cols., 1971. Os constituintes desta solução podem ser visualizados na Tabela 3. Após adição dos componentes, a solução era saturada por 15 min. com uma mistura carbogênica, contendo 95% de O2 e 5% de CO2, tendo ao final, o pH corrigido para 7,40. Para a perfusão

do lado seroso, a solução de Ringer recebia D(+) glicose na concentração de 5 mMl (Sigma; St. Louis, MO). Para a solução perfusora do lado mucoso, adicionava-se à solução de Ringer D(+) manitol na concentração de 100 5mM (Sigma; St. Louis, MO); (Soares e cols., 1991).

3.7.2.Preparação e fixação do tecido Ileal às câmaras de Üssing

Os coelhos, após um jejum de 24h, eram devidamente sacrificados, tendo em seguida o abdome aberto por incisão na linha mediana. Após rápida exploração abdominal o íleo era identificado, tomando-se como referência a junção ileocecal.

Ainda tomando-se como base a junção ileocecal, 25 cm de íleo distal era seccionado e colocado em solução de Ringer a 4oC. Em seguida, após lavagem da luz do conduto ileal com PBS a 4oC, era introduzida uma pipeta de 10ml, no segmento ileal e, logo após, era feita uma incisão superficial ao longo da margem da linha mesentérica para posterior retirada da camada serosa. Após isto, a incisão era aprofundada, e desta forma, obtinha-se a superfície mucosa exposta, que era mantida em uma placa de pectri, em banho de gelo. .

O retângulo assim obtido era dividido em fragmentos de cerca de 3cm em um dos lados e colocado entre duas hemi-câmaras de acrílico, com 1cm2 de área circular interna.

Na figura 9, pode-se verificar, de forma diagramatizada, os principais

de Üssing, de acordo com a metodologia descrita em Üssing & Zerahn, 1951; Schultz & Zalusky, 1964.

Figura 9. Preparação do íleo para fixação nas câmaras de Üssing. COELHO Jejum 24 h. 7 Segmento de íleo distal 1 0 Sacrifício do animal Retirada da membrana serosa BANHO DE GÊLO Memb. Íleal Fragmentos ~2,5cm Pipeta 10 em 1/10 Fixação da memb. ileal nas

hemi-câmaras Placa com Sol. Ringer Membrana Ileal nas C. Üssing

3.7.3. Montagem e funcionamento das câmaras de Üssing

Cada câmara era fixada em suporte adequado e simultaneamente preenchida com 0,8 ml de solução de Ringer glicosado e Ringer manitol nos lados serosos e mucoso, respectivamente, sendo em seguida, liberada a circulação dos 9,2 ml de perfusado, contidos nos tubos de circulação, previamente aquecidos e aerados, de acordo com o método descrito em Soares e cols., 1991.

A circulação e a aeração dos 10 ml de perfusado, em cada hemi-câmara e seu tubo de circulação correspondente, foram mantidas através de borbulhamento com uma mistura carbogênica, composta por 95% de oxigênio e 5% de gás carbônico.

A temperatura do perfusado era mantida a 37,8oC através de um sistema de circulação de água que envolvia as paredes de uma camisa de vidro que envolviam os tubos que recebiam o perfusado. Desta forma, o aquecimento homogêneo era mantido por meio de uma bomba de circulação de fluxo contínuo, com termostato ajustável.

As pontes de ringer-ágar eram confeccionadas, por meio de cânulas de polietileno (PE 205 e PE 280 com 1,57 e 2,15 mm de diâmetro interno, respectivamente), com uma solução de Ringer-ágar composta por 2,4g de ágar (Sigma, St. Louis, MO, USA) em 50 ml de Ringer. Essa solução era aquecida durante 30 min. e, logo em seguida, era injetada nas cânulas relatadas acima. A confecção das pontes de Ringer-ágar era realizada de acordo com a técnica descrita por Soares e cols., 1991.

Cada uma das pontes de polietileno de 1,57 mm de diâmetro interno foi conectada no orifício central de cada uma das hemi-câmaras, sendo o outro extremo imerso numa solução saturada de cloreto de potássio (KCl), juntamente com o eletrodo de calomel. Por outro lado, a ponte de 2,15 mm de diâmetro interno, foi conectada ao orifício distal de cada hemi-câmara e o outro extremo imerso em outros recipientes com solução saturada de KCL, contendo eletrodo de prata. A seguir, os pares de eletrodos, dois de calomel e dois de prata, eram conectados a um sistema de clampeamento de voltagem (Soares e cols., 1991).

Após todo este aparato técnico, os clampeadores eram ligados e o amperímetro zerado a fim de ser medido e registrado o potencial elétrico espontâneo, gerado pelo sistema. Caso o potencial espontâneo ultrapassasse os limites de +1,0 ou –1,0 mV, o sistema elétrico era desmontado e imediatamente refeito.

As medidas elétricas: corrente de curto-circuito, diferença de potencial e resistência transmembrana, eram realizadas em intervalos regulares de 10 minutos, durante todo o tempo de experimento.

O funcionamento das câmaras de Üssing era dividido nos seguintes períodos.

• Período inicial. As medidas elétricas monitoradas durante este período eram usadas como critério de triagem das condições do tecido. Caso estas medidas ultrapassassem muito a média das outras câmaras, a membrana era imediatamente substituída.

• Período de estabilização. (30 min.) Nesse período, foi dada uma atenção especial às variações de corrente de curto-circuito; se houvesse variações maiores que 20%, entre o final deste período e as leituras anteriores, a câmara era automaticamente eliminada do experimento.

• Período de adição. (60 min.) . Após o período de estabilização, as câmaras eram divididas de acordo com cada protocolo experimental. A seguir, era retirado 1,0 ml do perfusado. Os sobrenadantes de macrófagos, testes e controles, eram adicionados no volume de 1,0 ml, de tal maneira que o volume perfusado retornasse aos 10 ml.

• Período de teste funcional. (20 min). Independentemente do protocolo experimental empregado, no início deste período, eram retirados 200μl do perfusado e adicionado um volume equivalente de uma solução de teofilina a 10-

3

M, no lado seroso, com o objetivo de testar o estado elétrico final da membrana. Caso o clampeador de voltagem apresentasse uma sobrecarga de corrente, indicada no instrumento de registro como “over-load”, os dados obtidos nesta câmara eram descartados do protocolo considerado como válido experimentalmente.

Na figura 10 podem ser visualizados, resumidamente, os principais elementos integrantes do sistema de clampeamento de voltagem acoplado às câmaras de Üssing.

Figura 10. Câmara de Üssing e sistemas de aeração, aquecimento, fixação de voltagem e registro de sinais elétricos.

Mucoso Seroso