Organisering

Os rendimentos de hidrogênio alcançados por cada inóculo e EIM estão apresentados na Tabela 3.2. Os valores foram comparados pelo teste de Tukey. De acordo com os resultados alcançados, é possível afirmar que a adição de clorofórmio (CFO) resultou em efeito positivo mais significativo na produção de hidrogênio, pois foi a EIM que proporcionou os maiores rendimentos de H2 (p 0,05). Isso pode ser atribuído ao fato de o clorofórmio (a 0,05%, v/v) ser um agente seletivo, pois tem a capacidade de inibir apenas as archaeas metanogênicas (consumidoras de H2). Essa inibição seletiva foi comprovada por meio das análises do biogás, em que nenhum metano foi detectado quando empregado essa EIM, independentemente do inóculo utilizado.

O mecanismo de inibição pelo clorofórmio ocorre pela supressão da metil-coenzima M redutase presente apenas nas archaeas metanogênicas (HU; CHEN, 2007). Além disso, o clorofórmio pode se ligar aos corrinoides livres (forma análoga e ativa da vitamina B12) na célula microbiana, reduzindo as concentrações destes e bloqueando o funcionamento dessas

enzimas (HU; CHEN, 2007). Assim, uma EIM atuante na atividade enzimática parece ser mais eficiente do que CCL ou ACI, também comprovado por Hu e Chen (2007) e Zhu e Beland (2006).

Tabela 3.2 – Rendimentos de hidrogênio (em mol H2/mol glicerol) obtidos em cada cenário estudado. EIM Inóculo ES LR EC MX CTR C 0,036±0,003 b,c E 0,087±0,015 a H 0,019±0,001 c J 0,072±0,014 a,b CFO A 0,186±0,013 d D 0,208±0,043 d F 0,117±0,019 e I 0,172±0,001 d ACI B,C 0,072±0,006 f E 0,109±0,020 f G 0,068±0,007 f K 0,018±0,006g CCL B 0,100±0,007 h E 0,098±0,013 h,i G,H 0,042±0,010 j J 0,080±0,011 i Fonte: Elaborado pelo autor.

Notas: Os valores seguidos por letras diferentes diferem estatisticamente. A análise comparativa entre as estratégias de inibição da metanogênese (EIM) deve ser feita na vertical, tendo as letras maiúsculas como referencia. A análise comparativa entre os inóculos deve ser feita na horizontal, tendo as letras minúsculas como referencia. EIM = estratégia de inibição da metanogênese; ES = lodo floculento proveniente de um reator UASB que trata esgoto sanitário; LR = líquido ruminal, obtido a partir do estômago de caprino; EC = lodo granular oriundo de um reator secundário (metanogênico) de uma estação de tratamento de efluente de cervejaria; MX = mistura em iguais proporções volumétricas dos inóculos citados anteriormente; CTR: controle; CFO: adição de clorofórmio; ACI: choque de pH ácido; CCL: choque de calor.

Além das archaeas metanogênicas, o clorofórmio conseguiu inativar as bactérias homoacetogênicas, pois não houve consumo de H2 mesmo quando a metanogênese cessou. Apesar de algumas bactérias homoacetogênicas serem formadoras de esporos, Scholten, Conrad e Stams (2000) comprovaram, outrossim, que o clorofórmio é capaz de inibir esse grupo de micro-organismos.

Dentre todos os inóculos, o EC alcançou menor rendimento, aplicando CFO (0,117 mol H2/mol glicerol). Isso pode ter ocorrido devido à quantidade menor de bactérias acidogênicas nesse agregado microbiano, pois esse inóculo é proveniente de um reator secundário (metanogênico). Isso pode ser comprovado, comparando o rendimento médio

obtido por todos os inóculos quando nenhuma EIM foi aplicada (CTR), alcançando o EC menor valor (0,019 mol H2/mol glicerol).

Outros estudos já haviam demostrado a eficiência de clorofórmio em inibir a atividade metanogênica (CHIDTHAISONG; CONRAD, 2000; HICKEY; VANDERWIELEN; SWITZENBAUM, 1987; HU; CHEN, 2007; NING et al., 2012). Por outro lado, Wang e Wan (2008) concluíram que a adição de clorofórmio não é a melhor opção para potencializar a produção de H2, pois seu uso aumentou a duração da fase lag de 11,4 para 14,9 h e reduziu a produção de H2 em 19,3%, em comparação com o frasco controle. A concentração de clorofórmio a que esses autores submeteram o lodo (2%) pode ter sido a causa dos baixos rendimentos encontrados, pois é conhecido que concentrações acima de 0,05 – 0,10% podem inibir também a atividade das bactérias produtoras de hidrogênio (HU; CHEN, 2007; NING et al., 2012; WANG; WAN, 2008). Essa inibição pode se dar de forma direta ou indireta. De forma direta, o alto potencial redox (10,56 V) do clorofórmio se liga às enzimas forfinóide e corrinóide reduzidas que atuam na rota metanogênica, resultando em uma maior afinidade por estas enzimas reduzidas (LIN et al., 2014). Indiretamente, essa inibição ocorre: 1) pela formação de intermediários tóxicos e reativos durante a lenta degradação de alifáticos halogenados (VAN VLAARDINGEN; VAN BEELEN, 1994); 2) ou bloqueando o funcionamento da vitamina B12, como já explanado.

O ACI foi eficiente apenas aos inóculos ES e EC, uma vez que aumentou o rendimento de H2 em 2,0 e 3,6 vezes, respectivamente, em comparação ao CTR. Para o inóculo LR, ao ACI não teve efeito significativo (p 0,05). Já para o MX, o ACI reduziu o rendimento em 75%, mostrando que essa EIM pode inibir não só a metanogênese, como também as bactérias produtoras de hidrogênio (Figuras 3.3 e 3.4).

Diversos pesquisadores comprovaram o efeito deletério do ACI a culturas mistas (REN et al., 2008; ROSSI et al., 2011; ZHU; BÉLAND, 2006). Hu e Chen (2007) também não recomendam o ACI, pois apresentou rendimentos menores que o do frasco controle. Os baixos valores encontrados para os inóculos LR e MX podem ser explicados pelo fato de que outras bactérias produtoras de H2, por exemplo, as do gênero Enterobacter e Klebsiella, não sobrevivem a um choque de pH ácido, pois têm faixa ótima de pH entre 5,0 e 6,5, reduzindo, por conseguinte, o rendimento do processo (ROSSI et al., 2011). Zhu e Béland (2006) atribuíram a baixa eficiência do choque ácido à queda de pH do meio durante a fermentação para menos de 4,0. No entanto, no presente experimento, o menor pH foi 5,2, valor

considerado dentro da faixa adequada à produção de H2. Em contrapartida ao resultado desta pesquisa, Cheong e Hansen (2006) concluíram que o choque ácido foi o mais eficiente dentre cinco EIM estudadas (ácido, BES, calor úmido, calor seco e congelamento).

Apesar de o choque de calor ser a estratégia mais empregada para selecionar BPH (WANG; WAN, 2008), este se mostrou uma estratégia bastante agressiva, pois eliminou tanto archaeas metanogênicas como afetou a atividade das BPH. Além de eliminar as BPH não formadoras de esporos, essa EIM também reduz a diversidade microbiana no meio, que pode afetar as relações de simbiose e sintrofia ocorridas na produção de H2, utilizando culturas mistas como inóculo (REN et al., 2008). Dessa forma, o rendimento do processo será afetado negativamente.

Em contrapartida, Hu e Chen (2007) conseguiram aumentar o rendimento de 0,4 para 118,3 mL H2/g glicose quando se aplicou choque de calor ao lodo granular por 30 minutos. A eficiência observada no referido trabalho em selecionar BPH pode ser explicada pela fonte do inóculo, pois eles utilizaram lodo proveniente de reator anaeróbio tratando efluente à base de amido, um substrato que necessita de uma alta atividade acidogênica/hidrogenogênica para hidrólise e conversão a ácidos. Já o lodo granular utilizado na presente pesquisa é um lodo proveniente de reator UASB metanogênico, composto essencialmente por archaeas. Rossi et al. (2011), igualmente, apontaram o choque de calor como a EIM mais eficiente em selecionar BPH, se comparado a outras estratégias. Esses pesquisadores aumentaram o rendimento de H2 em cerca de 4,3 e 3,4 vezes, quando submeteram o inóculo a calor seco e úmido (fervura), respectivamente.

Vale salientar que o CCL conseguiu eliminar totalmente as bactérias homoacetogênicas, pois não houve acúmulo de ácido acético. Logo, conclui-se que o consumo de H2 ocorrido nos últimos dias do experimento pode ser atribuído à ação de bactérias que utilizaram diretamente o H2 como doador de elétrons e prótons no alongamento de cadeia (ß-oxidação reversa) para formar ácido caproico (C6), como descrito por Ding, Tan e Wang (2010) e Steinbusch et al. (2011). Esse consumo foi mais evidente para o lodo granular, quando a concentração de H2 no biogás chegou a zero e a de C6 foi de 1,2 g/L. Entretanto, esta hipótese pode ser contestada, seja pelo fato de C. kluyveri (principal micro- organismo responsável pelas reações de alongamento de cadeia) não ter sido capaz de utilizar H2 como doador de elétrons (KENEALY; WASELEFSKY, 1985) ou porque esta rota metabólica não foi ainda totalmente elucidada.

Uma alternativa para diminuir o nível de agressividade do CCL e evitar decaimento de BPH formadoras de esporos seria aplicar menores temperaturas, prolongando o tempo de contato. Lay et al. (2005) conduziram testes em batelada, utilizando planejamento experimental para verificar o efeito da temperatura e do tempo na seleção de BPH, e encontraram que os maiores rendimentos de H2 são alcançados quando o inóculo foi exposto a 80˚C por 12 horas. Outros pesquisadores trabalharam sob condições semelhantes, e nenhum metano foi detectado no biogás (AZBAR et al., 2009; FAN; CHEN, 2004).