Indiscutivelmente, as orientações e guias de validação estão em constante avanço, porém, são as preconizações, descritas, que garantem o bom planejamento das condições para validação das metodologias analíticas.
Alguns comentários têm sido reportados pela bibliografia científica para diversas aplicações. A exemplo de Dadgar at al (1995) que fazem uma explanação sobre o estudo da seletividade nos inter e intra-ensaios, onde são discutidos os tipos de interferentes, que podem influenciar o estudo destas figuras, desde a presença de substâncias endógenas, produtos de degradação e até mesmo a contaminação por interferentes do ar e ambiente. Com relação aos parâmetros da curva analítica, os pesquisadores afirmam que o limite de quantificação deve ser referenciado a partir do limite de detecção, sendo o LQ três vezes maior que o LD. Ainda, segundo Chasin et al. (1998), o LD é a menor concentração ou quantidade de uma substância que pode ser identificada, por um procedimento analítico com um nível de confiança especificado sendo, estatisticamente, diferenciada do ruído. Van de Merbel (2008) mostra as desvantagens para determinação quantitativa dos compostos endógenos, em amostras biológicas, por técnicas cromatográficas e enfatiza o efeito de matriz. Neste ponto, Cassiano et al.(2009) e Matuszewski, Constanzer e Chavez-et al (2003b) enfatizam que esse efeito ocorre quando substâncias inerentes à matriz biológica concorrem com os compostos de interesse, comprometendo os a eficiência dos métodos Bioanalíticos, tais como: HPLC/fluorescência, HPLC/UV, e HPLC-MS/MS.
A ANVISA (2003) propõe um guia de validação, onde é expresso o cálculo das figuras de mérito, o desenvolvimento de metodologia tem sido aceito em todo o país. Inicialmente, para Shabir (2003), a robustez de um método consiste na capacidade de não ser afetado por pequenas variações, deliberado pelos parâmetros dos procedimentos. De maneira que, esse parâmetro, na cromatografia, é avaliado, variando-se as condições como: solvente orgânico, pH do tampão na fase móvel, força iônica, colunas e temperatura. Shah et al (2000), mostra que uma validação bem-sucedida, reúne critérios específicos de aceitação para a exatidão e precisão.
A Tabela 3.4 apresenta as principais características de um método bem executado, sendo que esta descrição. Além disso, as instruções, sobre as figuras de mérito, presentes nos manuais da Emea (2012a), Codex Alimentarius (2014), ICH (2005) e trabalhos de Bressole, Bromet- Petit e Audran (1996).
Já o guia do FDA (2011) confirma que a avaliação da robustez deve ser considerada, durante toda a fase de desenvolvimento do método, em estudo, mostrando a confiabilidade de uma análise, considerando as variações em parâmetros do método.
Tabela 3.4-Comparação dos requisitos de validação preconizados para quantificação dos resíduos em alimentos
Características Norma legal praticada pelas organizações
CAC/GL 72-2009 2002/657/EC VICH GL 49
Estabilidade do analito
É o estudo de armazenamento por um período que se estende até,
90 dias além do tempo esperado, para o rastreio,
quantificação e confirmação do analito.
Sempre que possível, usa- se amostras reais. Quando
não, é utilizado a matriz fortificada com a substância. Análises são realizadas a cada 1, 2, 4 e 20 semanas, as amostras
armazenadas a -20 ºC.
Controle do tempo de armazenamento e suas condições. Esta etapa é parte
do processo de validação. Realização de um estudo de
estabilidade da matriz. As amostras devem ser fortificadas (3 dias).
Teste de robustez
O teste utilizando o controle dos pontos críticos. Variando-se as condições analítica tais como: nos volumes de
reagentes,
concentrações, pH, tempo de retenção, qualidade
reagente e lotes.
Avaliação dos métodos incluem espécies, matrizes
e abertura de amostras diferentes. A importância das é avaliada, utilizando a
abordagem de Youden.
Induzir situações de modificações ao longo do tempo. As mudanças podem
incluir: lotes de reagentes, composição e volume, número de extrações, marca
coluna.
Curva Analítica
É a primeira etapa que avalia a resposta dos padrões, diante faixa de
trabalho. Estas concentrações (mínimo de
cinco branco). Deve recobrir o LMR
Para construção da curva deve ser utilizada, pelo
menos, cinco níveis (incluindo o zero). Definindo o intervalo de concentração, indicando a
equação da curva,
É determinada por toda a faixa de trabalho da concentração do analito na matriz. A execução depende de três tipos de metodologia: padrões de solvente/tampão, matriz de controle e adição
de padrões.
Linearidade
É determinada pela análise de regressão linear admitindo a resposta
linear.
NF
É por equação linear, definida por relação concentração versus a resposta 5 níveis de concentrações. Teste de robustez O teste utilizando o controle dos pontos críticos. Variando-se as condições nos volumes de
reagentes, concentrações, pH, tempo de retenção,
qualidade reagentes.
Avaliação dos métodos incluem espécies, matrizes
e abertura de amostras diferentes. A importância das é avaliada por Youden.
Induzir situações de modificações, que podem incluir: lotes de reagentes, composição e volume, número de extrações, marca
coluna analítica e lotes e eluição HPLC
Sensibilidade
É a concentração mais baixa à qual o analito pode
ser detectado, dentro de limites estatísticos.
Calculado com adição de padrão interno.
Simultaneamente com a robustez.
Tabela 3.4-Comparação dos requisitos de validação preconizados para quantificação dos resíduos em alimentos
(continuação)
Características Norma legal praticada pelas organizações
CAC/GL 72-2009 2002/657/EC VICH GL 49
Seletividade Capacidade de um método identificar a resposta de sinal do composto, na presença de outras substâncias. É a capacidade de um método distinguir o analito
de outras substâncias. É a capacidade de avaliar o analito na presença de componentes endógenos, produtos de degradação e medicamentos veterinários. A
resposta deve ser LQ < 20%.
Exatidão
A precisão de uma medição está relacionada
com erro sistemático (bias método analítico) e
%recuperação. A precisão deve ser, cuidadosamente, caracterizada em concentrações de 0,5LMR e 2 LMR.
É o grau de concordância entre o resultado do ensaio
e o valor de referência aceito. É determinada através da veracidade e da precisão. O cálculo da veracidade consiste no quociente entre concentração média detectada corrigida pela
recuperação.
É o grau de concordância entre o valor real da concentração de analito e o
resultado da média, obtido através da aplicação dos
procedimentos. %Recuperação. O critério é: < 1 µg/kg (-50 a +20 %). ≥ 1 < 10 µg kg-1 (-40 a +20 %) ≥ 10 < 100 µg kg-1 (-30 a +10 %) ≥ 100 µg kg-1 (-20 a +10 %) Precisão É expresso, em termos da variação, pela repetabilidade e reprodutibilidade. Sendo
descrita pelo desvio- padrão ou coeficiente de variação. É o grau de concordância entre o resultado de um ensaio e o valor de referência aceito. É determinada pela veracidade e precisão É o grau de concordância entre resultados de testes independentes, deve incluir arepetabilidade. O critério de aceitação (%CV): < 1 µg/kg 30 % ≥ 1 µg/kg < 10 µg/kg 25 % ≥ 10 µg/kg < 100 µg/kg 15% ≥ 100 µg/kg 10 % Limite de Detecção (LQ)
Pode ser determinado pela leitura de amostras
representativas. Em alguns casos é necessário
fortificar para obter detecção aceitavel.
É estabelecido pelo Limite de decisão (CCα) e Capacidade de Detecção
(CCβ).
É a menor concentração medida para o analito.
Limite de Quantificação (LQ) Deve satisfazer os critérios de precisão e exatidão (recuperação). Deve ser LQ ≤ LMR. Deve ser 0,5 LMR.
É estabelecido pelo Limite de decisão (CCα) e Capacidade de Detecção
(CCβ).
É a menor concentraçã medida do analito, a partir do qual a determinação pode ser feita, com o grau específico de
exatidão e precisão.
Não obstante, Rozet et al (2011) ressalta que as figuras de méritos não se restringem apenas aos métodos cromatográficos, mas também aos imuno-ensaios. Os pesquisadores enfatizam que a incerteza de medição, lembra aos analistas que o resultado é a estimativa real
CAPÍTULO 4
METODOLOGIA
4 METODOLOGIA
Todas as análises foram realizadas nas dependências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte no Instituto de Química em Laboratórios da Central Analítica. As metodologias foram aplicadas, exclusivamente, para fins Acadêmicos, satisfazendo todo o cronograma para a execução desta Tese.