dados)
Sistema de
Introdução da
Amostra
1. Introdução 1.3. Espectrometria de Massa
13 O detector é o último elemento do espectrómetro de massa e consiste geralmente num multiplicador de electrões.
1.3.1.Ionização
Existem vários métodos de ionização, sendo que os mais utilizados são a ionização electrónica (EI), a ionização química (CI), a ionização por electrospray (ESI), a ionização química à pressão atmosférica (APCI), o bombardeamento com átomos/iões rápidos (FAB) e a ionização/desadsorção laser assistida por matriz (MALDI).[51, 55] Para cada amostra e tipo de estudo existe um método de ionização adequado, onde o sistema de introdução da amostra pode variar. [56]
1.3.1.1.Ionização por Electrospray
A ionização por electrospray (ESI) é uma técnica de ionização suave que permite a preservação, em fase gasosa, das interacções não-colaventes entre moléculas que existem em solução.[57] Existem quatro tipos normalmente referidos de interações não-covalentes que são as ligações de hidrogénio, as ligações iónicas, as forças de van der Waals e as interações hidrofóbicas. Neste trabalho a técnica de ionização utilizada foi o electrospray (ES), pois esta técnica permite estudar um heterodímero, que se trata de um ião constituido por dois aniões resultantes de compostos diferentes, neste caso, do composto em estudo e da referência ligados por um protão.[33]
A ESI distingue-se por:
• Ter a capacidade de produzir iões multiplamente carregados com um número de carga elevado, reduzindo a razão m/z, tornando possível analisar compostos de elevada massa molecular, mesmo em espectrómetros de massa com um mass range limitado.
• As amostras a analisar devem ser introduzidas em solução, o que faz com que seja possível o acoplamento com muitas técnicas de separação.
• Como a técnica de ionização é suave permite que as interacções não-colaventes entre moléculas que existem em solução sejam preservadas em fase gasosa.[58]
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Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
A ionização por electrospray (ESI) é compatível com todos os tipos de cromatografia, mas neste estudo não foi necessário aplicar uma técnica hifenada, fazendo-se a injecção directa da solução em estudo.
No caso da ionização por electrospray (ESI), a fonte encontra-se à pressão atmosférica e a evaporação do solvente é potenciada por um fluxo contra corrente de um gás (azoto). Os iões gerados à pressão atmosférica são depois transferidos para o analisador de massa que se encontra em vácuo.[59]
A produção de iões em electrospray divide-se essencialmente em dois passos, na dispersão de gotas altamente carregadas e na evaporação da gota. Inicialmente, a amostra é introduzida em solução através de um capilar de aço inoxidável. A ponta do capilar, onde o analíto em solução é introduzido e pulverizado, é mantido a um potencial relativamente elevado em relação a um contra-eléctrodo, levando à formação de gotas pequenas e altamente carregadas (figura 1.9). Posteriormente, as moléculas do analíto são separadas do solvente, na forma de iões.[57, 59, 60]
Figura 1.9 – Diagrama esquemático de uma fonte de ionização de um electrospray (ESI).
A formação de iões é provavelmente a parte menos compreendida do processo de electrospray.[59] Existem alguns modelos propostos para a formação de iões, sendo os principais o modelo de carga residual e modelo de evaporação iónica.[59, 61]
No modelo de carga residual, os iões são formados a partir de gotas carregadas, este modelo envolve três passos: (1) a densidade de carga aumenta com a evaporação do solvente, levando (2) a que as forças de repulsivas de Coulomb entre as cargas superficiais
1. Introdução 1.3. Espectrometria de Massa
15 ultrapassem a tensão superficial, originando (3) a divisão da gota inicial. Este processo continua até que cada gota contenha apenas uma única molécula, que terá parte da carga inicial, formando os iões (figura 1.10).
Figura 1.10 – Modelo de carga residual.
No modelo de evaporação iónica, os iões formam-se em três passos: (1) a dispersão de um spray fino de gotículas carregadas, seguidas pela (2) a evaporação do solvente e (3) a ejecção de iões a partir das gotículas altamente carregadas. Este mecanismo foi aplicado por Fenn (figura 1.11).
Figura 1.11 – Modelo de evaporação iónica.
Assim, a solução que emerge do capilar é dispersa num aerossol com gotículas carregadas por acção do campo eléctrico acima referido e de um gás nebulizador (azoto). As gotículas diminuem a sua dimensão através da evaporação assistida pelo gás de secagem ou contra-corrente.Sendo a amostra convertida maioritariamente em iões livres de solvente. Os iões passam por um skimmer(s) para uma zona de pressão inferior à pressão atmosférica. O(s) skimmer(s) são cone(s) com um orifício pequeno (figura 1.9), que permitem estabelecer um gradiente de pressão entre a fonte iónica e o analisador.[59] O skimmer actua também como um separador de momento, separando os iões amostra, mais pesados, das moléculas, mais leves, do solvente e do gás. Posteriormente, os iões são transferidos para o analisador onde são medidas as razões m/z.
1.3.2.Analisador
Os analisadores utilizados neste estudo foram a ion trap e o FTICR (Ressonância Ciclotrónica de Iões com Transformada de Fourier).
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Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1.3.2.1.Ion trap
A ion trap é constituída por três eléctrodos aos quais são aplicados potenciais, formandouma rede de captura que aprisiona as partículas carregadas ou os iões gasosos. Dois desses eléctrodos são os eléctrodos endcap, que apresentam uma geometria hiperbólica (figura 1.12). Um dos eléctrodos endcap tem pequenos orifícios através dos quais os iões passam periodicamente para o analisar, enquanto que o outro tem vários orifícios pequenos que estão dispostos centralmente e pelos quais os iões passam em direcção ao detector. O terceiro eléctrodo é um eléctrodo anelar, que está posicionado entre os dois eléctrodos endcap.[62, 63]
Figura 1.12 – Representação esquemática de uma ion trap.
Assim, os iões produzidos na fonte entram na ion trap, onde são aplicadas várias voltagens entre os eléctrodos, de modo a aprisionar e ejectar os iões de acordo com as suas razões massa/carga (m/z).[49]
As voltagens aplicadas têm duas componentes, a corrente alterna (AC) e as radiofrequências (rf). Ao entrarem num campo eléctrico, os iões oscilam e, a uma determinada radiofrequência, os iões de uma determinada massa estão num estado de oscilação que os leva a descrever uma trajectória estável que lhes permite atravessar a ion trap e chegar ao detector. Dentro destas condições nem todas as massas alcançam um estado de oscilação que lhe permita ter uma trajectória estável, ficando retidas nas paredes da ion trap, permitindo que haja separação de massas.[51, 53, 62]
A voltagem da AC é alterada para variar a resolução. Se a voltagem AC estiver desligada, a ion trap opera apenas em modo rf.[52] Neste caso, a ion trap não está a ser
1. Introdução 1.3. Espectrometria de Massa
17 utilizada como analisador, mas antes como célula de colisão, permitindo a execução de espectrometria de massa tandem.[53, 64]
1.3.2.2.FTICR
O FTICR (Ressonância Ciclotrónica de Iões com Transformada de Fourier) envolve a acção simultânea do campo eléctrico e magnético para confinar os iões numa região finita do espaço e aí os analisar e detectar. Toda a experiencia de FTICR ocorre numa célula de confinamento de iões formada por três pares de pratos em oposição que têm funções específicas de confinamento, excitação e detecção dos iões a serem analisados (figura 1.13).[49, 65, 66]
Figura 1.13 – Representação esquemática de um FTICR.
A célula está colocada na zona homogénea do campo magnético confinando cada ião radialmente, obrigando-o a descrever um movimento ciclotrónico com uma frequência que é função da respectiva razão massa/carga, enquanto o campo eléctrico gerado por um potencial electrostático é aplicado nos pratos de confinamento mantendo o ião num fosso de potencial na direcção de z, que corresponde ao campo magnético da figura 1.13.[46, 67]
Os três movimentos naturais do ião são o movimento ciclotrónico, o movimento do magnetrão e a movimento por aprisionamento (figura 1.14). No entanto, as frequências do magnetrão e do movimento por aprisionamento são muito mais baixas que as frequências ciclotrónicas, não sendo geralmente detectadas.[65, 67]
18
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Figura 1.14 – Movimentos naturais do ião, onde νm é a frequência do magnetrão, νc é a frequência ciclotrónico e νT é a frequência por aprisionamento.
O movimento ciclotrónico só por si não é muito útil. Deste modo, todas as aplicações se baseiam na excitação por aplicação de um campo eléctrico espacialmente uniforme com frequência igual, ou próxima, à frequência ciclotrónica dos iões de uma dada razão massa/carga. A excitação em FTICR é usada de três formas (figura 1.15):
• para acelerar coerentemente os iões até trajectórias com raios maiores, tornando possível a sua detecção;
• para aumentar a energia cinética do ião acima do limite de dissociação iónica e/ou para a reacção ião-molécula;
• para acelerar os iões até trajectórias com raio superior ao raio da célula de modo a removê-los (ejecção).[46, 67, 68]
Figura 1.15 – Três forma de aplicar a excitação. Esquerda: aceleração dos iões até uma trajectória espacialmente coerente e detectável. Centro: Aumento da energia cinética acima do limite para a dissociação
activada por colisão ou reacção. Direita: ejecção dos iões de uma dada razão massa/carga.
Desta forma, os iões presentes na célula, são sujeitos a um campo eléctrico oscilante de radiofrequências (rf), transmitido através dos pratos de excitação. Quando as radiofrequências entram em ressonância com as frequências de ciclotrão dos iões, há absorção de energia que obriga os iões a deslocarem-se para uma órbita com maior raio, aproximando-se dos pratos de detecção, induzindo aí uma corrente.[65, 67] Essa corrente é
1. Introdução 1.3. Espectrometria de Massa
19 uma sobreposição das frequências de ciclotrão dos diferentes iões sujeitos a excitação, com amplitudes que são proporcionais ao número de iões. O sinal trasiente é convertido numa voltagem, digitalizado e sujeito a uma transformada de Fourier, a qual revela as frequências e intensidades que são depois convertidas em massas e abundâncias iónicas (figura 1.13).[65,
69]
O FTICR-MS foi acoplado a todos os tipos de fontes iónicas, onde se observou que a maioria funcionava melhor fora do campo magnético. Assim, foram desenvolvidos vários métodos para conduzir os iões, gerados externamente, para a célula.
Tal como na ion trap é possível realizar experiências de espectrometria de massa tandem, na célula do ICR.[46, 70]
Como pudemos observar ambos usaram a mesma técnica de ionização, sendo ela, o electrospray (ES). A distinção entre os dois espectrómetros, foi o analisador, sendo que um tinha a ion trap e o outro o FTICR. Apesar dos dois analisadores serem diferentes, ambos são capazes de funcionar como câmaras de colisão permitindo realizar espectrometria de massa tandem, que foi vital para efectuarmos a determinação experimental dos parâmetros termoquímicos, em fase gasosa, descritos em capítulos anteriores.
1.3.3.Detectores
O detector é o último elemento do espectrómetro de massa, onde se converte a corrente iónica em electrões ou fotões. Existem vários tipos de detectores, sendo um dos mais comuns o multiplicador electrónico ou o fotomultiplicador.[48]
O detector da ion trap utilizada neste trabalho é um multiplicador de electrões.[71] O multiplicador de electrões utiliza uma tensão de aceleração sobre os iões levando-os a embater num dínodo de conversão produzindo uma emissão secundária de electrões, que sofre multiplicação por embate nos estágios seguintes do multiplicador. A corrente iónica é, assim, convertida em corrente eléctrica que é amplificada e susceptível de ser medida.
1.3.4.Espectrometria de massa tandem com dissociação induzida por colisão (CID)
A espectrometria de massa tandem consiste na activação de um ião primário, “ião percursor”, que é dissociado ou reage, dando origem a um ião ou mais iões secundário que são analisados, “iões produto”. Para realizar espectrometria de massa tandem, um
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Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
espectrómetro de massa deve ser constituído, normalmente, por dois ou mais analisadores. No primeiro analisador, selecciona-se e isola-se um ião com uma razão m/z, que é transferido para uma câmara de colisões onde é excitado e sofre posterior fragmentação. A fragmentação é realizada habitualmente através de dissociação induzida por colisão (CID) com um gás. Seguidamente, faz-se a análise de massa dos iões fragmento num segundo analisador de massa.[49, 72, 73]
Neste trabalho experimental, utilizaram-se equipamentos com um único analisador, uma ion trap e um FTICR, que pode funcionar como célula de colisões e realizar várias análises de massa sucessivas. Estes passos ocorrem com separação temporal. Na ion trap, a CID é realizada, geralmente, na própria ion trap que funciona como câmara de colisões, onde um gás inerte (hélio ou outro) presente na célula de colisão, bombardeia os iões seleccionados da amostra, causando a sua fragmentação. No FTICR, a CID é realizada, geralmente, na célula do ICR funcionado como câmara de colisões colidindo com um gás, onde é aplicada uma frequência que vai excitar os iões seleccionados, causando a sua fragmentação. A CID de uma espécie iónica isolada, tanto na ion trap como no FTICR, é uma técnica poderosa para a determinação da estrutura de iões.[73] No entanto, neste estudo, esta técnica, CID, irá permitir o estudo da decomposição do heterodímero, para aplicação do método cinético.[23, 34]
Uma das vantagens da espectrometria de massa tandem é que podemos utilizar compostos sem purificação prévia, pois podemos selecionar e isolar o ião de interesse.
Como foi referido anteriormente, para além da determinação experimental da acidez em fase gasosa de alguns fenóis substituídos, também se fez o estudo teórico desses mesmos compostos. A termoquímica de fase gasosa utiliza os cálculos teóricos na confirmação dos valores obtidos e também na informação estrutural que é dificilmente obtida por espectrometria de massa.
O objectivo final é determinar da entalpia de dissociação da ligação O-H, DHᵒ (ArO-H), nesses mesmos compostos. Assim, este estudo vai dividir-se em duas partes, num estudo da acidez e num estudo das afinidades electrónicas. O estudo teórico da acidez vai complementar o trabalho experimental, pois vamos obter um valor que deve confirmar o valor obtido experimentalmente, para além de esclarecer o grupo funcional em que ocorre a desprotonação. O estudo teórico das afinidades electrónicas foi feito apenas teóricamente, dada a dificuldade de o obter experimentalmente.
2. Parte Experimental 2.1 Reagentes
21
2.
Parte Experimental
2.1.Reagentes
Os compostos em estudo foram o 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)propenoic acid (ácido cafeico) e o (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (trolox), que foram obtidos na Sigma-Aldrich e utilizado sem purificação prévia. Também o
α
,α
,α
-tocopherol (vitamina E), obtido na Acros Organics, foi objecto de estudo e utilizado sem purificação prévia. As principais características dos compostos em estudo encontram-se descritas na tabela seguinte (tabela 2.1).O solvente escolhido foi o metanol, obtido no VWR com uma pureza de 99,8%. A selecção do solvente é importante, pois tem que ser capaz de dissolver a amostra completamente, caso contrário, a amostra pode precipitar e bloquear o capilar da fonte de ionização utilizada.
Tabela 2.1 – Características dos compostos em estudo.
Composto Fórmula estrutural
Fornecido por (grau de pureza) Massa Molecular (Da) Razão m/z da molécula desprotonada [R-] Trolox (C14H18O4) Sigma- Aldrich (97,0%) 250,29 249 Ácido Cafeico (C9H8O4) Sigma- Aldrich (98,0%) 180, 16 179
α
,α
,α
- tocopherol (C29H50O2) Acros Organics (98,0%) 430,71 429Os compostos utilizados como referências para este estudo foram o fenol, o 4- fluorofenol, o 4-clorofenol, o ácido benzóico, o 3-(Trifluorometil)fenol, o 4- (Trifluorometil)fenol, o ácido nicotínico, a 4-hidroxiacetofenona, o ácido 4-hidroxibenzóico, o 4-hidroxibenzoato de metilo, o ácido 4-cianobenzóico, o ácido 2-hidroxibenzóico, o ácido
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Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
2,5-dihidroxobenzóico, o ácido 2,4,6-trihidroxiacetofenona e o ácido pícrico. Estas referências foram obtidas de diferentes fornecedores (tabela 2.2), tendo sido utilizadas sem qualquer purificação.
Tabela 2.2– Características dos compostos de referência utilizadas neste estudo.
Compostos de Referência Fórmula estrutural Fornecido por (grau de pureza) Massa Molecular (Da) ∆acH (kJ/mol) ∆acG (kJ/mol) 3,4-Dimetilfenol (C8H10O) Sigma-Aldrich (98,0%) 122,16 1467 1436 4-Metilfenol (C7H8O) Sigma-Aldrich (98,0%) 108,14 1465 1437 Cromanol (C14H20O) Sigma-Aldrich (99,0%) 221,13 1465 1434 4-Etilfenol (C8H10O) Sigma-Aldrich (98,0%) 122,16 1463 1435 3,4- Dimetóxidofenol (C8H10O3) Sigma-Aldrich (98,0%) 154,16 1462 1431 Fenol (C6H6O) Sigma-Aldrich (98,0%) 94,11 1462 1431 4-Fluorofenol (C6H5OF) Sigma-Aldrich (99,0%) 112,10 1451 1422 4-Clorofenol (C6H5OCl) Sigma-Aldrich (99,0%) 128,56 1435 1407
2. Parte Experimental 2.1. Reagentes
23
Tabela 2.2 – Continuação das características dos compostos de referência utilizadas neste estudo.
Composto de Referência Fórmula estrutural Fornecido por (grau de pureza) Massa Molecular (Da) ∆acH (kJ/mol) ∆acG (kJ/mol) 3-(Trifluorometil) fenol (C7H5F3O) Sigma-Aldrich (99,0%) 162,11 1419 1391 4-Hidroxibenzoato de metilo (C8H8O3) Panrec (99,8%) 152,15 1410 1382 4-(Trifluorometil) fenol (C7H5F3O) Sigma-Aldrich (99,0%) 162,11 1410 1381 Ácido 4- hidroxibenzóico (C7H6O3) Acros Organics (99,8%) 138,12 1405 1376 4-hidroxi- acetofenona (C8H8O2) Acros Organics (99,8%) 136,15 1404 1375 Ácido Nicotínico (C6H5NO2) Acros Organics (99,8%) 123,15 1399 1370 Ácido 4- cianobenzóico (C8H5NO2) Acros Organics (99,0%) 147,13 1372* 1342 Ácido 2- hidroxibenzóico (C7H6O3) Sigma-Aldrich (99,0%) 138,12 1362 1330 Ácido 2,5- dihidroxibenzóico (C7H6O4) Fluka (98,0%) 154,12 1360* 1329
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Correlação da função antioxidante a com energia de ligação O-H em compostos fenólicos. Tabela 2.2 – Continuação das características dos compostos de referência utilizadas neste estudo.
Composto de Referência Fórmula estrutural Fornecido por (grau de pureza) Massa Molecular (Da) ∆acH (kJ/mol) ∆acG (kJ/mol) Ácido 2,5- dihidroxibenzóico (C7H6O4) Fluka (98,0%) 154,12 1360* 1329 Ácido pentafluoro Benzóico (C8H8O4) Sigma-Aldrich (99,0%) 212,07 1354 1325 Ácido 2,4,6- trihidroxibenzóico (C8H8O4) Acros Organics (98,0%) 168,15 1353 1324 Ácido Pícrico (C6H3N3O7) Sigma-Aldrich (99,0%) 229,10 1298 1267
* Valores calculados utilizando uma relação da literatura.[23]
2.2.Procedimento Experimental 2.2.1.Preparação das soluções
Neste estudo de compostos fenólicos em fase gasosa recorreu-se ao uso de soluções com concentração de 10-4 M. Para tal, começou-se por pesar o composto em estudo (por exemplo 0,02519g de trolox, ou 0,01801g de ácido cafeico ou 0,04301g de vitamina E) numa balança Sartorius CP225D, que foi dissolvido em 1000 µl de metanol, originando uma solução de 10-1 M. Essa solução sofreu diluições sucessivas até originar uma solução de 10-3 M. Para a preparação da referência utilizou-se o mesmo método, alterando-se apenas a massa de composto de acordo com a referência a utilizar.
Deste modo, preparou-se uma solução de 10-3 M do composto em estudo e da referência. De seguida, retirou-se uma alíquota de 100 µl de cada solução, que se juntaram, formando uma solução com 200 µl que foi completa com metanol para originar uma solução de 1000 µl com uma concentração da ordem dos 10-4 M.
2. Parte Experimental 2.2. Procedimento Experimental
25 Depois de preparadas as soluções, introduziram-se no espectrómetro de massa com o fim de serem analisadas.
2.2.2.Condições Experimentais para aplicação do Método Cinético
Quando introduzimos a solução no espectrómetro temos de selecionar as condições experimentais de modo observar os iões na forma aniónica ou catiónica. Para estudar a acidez necessitamos que se formem aniões, para tal o modo que vai se empregue neste estudo vai ser o modo negativo. Com este modo, é possível observar os aniões resultantes da dissociação do ácido em estudo, originando o ião do ácido (AcO-) e o protão (H+), isto é,
75 → 756+ (25)
Após as soluções serem preparadas, contendo o composto em estudo e uma referência, injectaram-se directamente no espectrómetro de massa, através de uma bomba de seringa (a velocidade constante de 5 µl/min). Os espectrómetros de massa utilizados para aplicar o método cinético foram o LCQ Duo Thermoquest da Finnigan e o FTICR (Ressonância Ciclotrónica de Iões com Transformada de Fourier) da Bruker Daltonic.
O LCQ Duo Thermoquest da Finnigan é constituído por um analisador de massa ion trap e equipado com uma fonte de ionização electrospray, estando acoplado a um computador equipado com o software Xcalibur, que permite o controlo do aparelho e a aquisição, armazenamento e processamento de dados.[71] Neste espectrómetro de massa, foi aplicado o método cinético restrito e o método cinético estendido.
Para aplicar o método cinético, todos os parâmetros do espectrómetro de massa foram optimizados para cada experiência para melhorar as razões sinal/ruído para os iões de interesse. Assim, houve parâmetros que se mantiveram constantes em todas as experiências como a voltagem aplicada ao spray na fonte que foi de 4,5 kV e a temperatura que foi de 200ᵒC. De modo a maximizar a abundância do heterodímero, optimizou-se a voltagem aplicada no capilar e no tube lens offset.
O gás nebulizador e o gás auxiliar utilizado foi em ambos os casos o azoto. A pressão medida durante as experiências no skimmer foi de 1,21 Torr e a pressão no ion trap com a adição de hélio foi de 2,33x10-5 Torr.
Fez-se um estudo do comportamento dos compostos em estudo (trolox, ácido cafeico e α-tocoferol) em modo negativo e positivo, observando os iões mais abundantes
26
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
em cada caso. Também se fez um estudo da concentração e do solvente a utilizar, para obter o melhor sinal para os iões em estudo.
Finalmente, fez-se a determinação da acidez em fase gasosa dos mesmos compostos em modo negativo, logo na sua forma aniónica. Para tal, variaram-se as energias de colisão aplicadas, após isolarmos o ião heterodímero. Variaram-se as energias de colisão normalizada no intervalo de 5 a 20%, tendo sido feito em média 5 ensaios a cada energia de colisão normalizada.[74] Como se pode observar, estas energias de colisão normalizadas (NCE) vêm expressas em percentagem, logo têm de ser transformadas em voltagens pico a pico (Vp-p), através da seguinte equação
8
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(26)
Onde m/z é a razão massa/carga, a e b são pârametros experimentais.[75, 76]
O FTICR tem a capacidade de aplicar dois métodos de ionização distintos, a ionização por electrospray (ES) e por MALDI (Ionização/ Desadsorpção da Matrix Assistida por Laser), sendo que nesta experiência utilizou-se a ionização por electrospray (ES). O analisador de