Os TGS compreendem um grupo morfológico e clinicamente diverso de neoplasias. Estes tumores são raros, especialmente quando afetam as glândulas salivares menores, onde eles representam de 9 a 23% de todas as neoplasias de glândulas salivares (EVESON, CAWSON, 1985; WALDRON et al., 1988; ITO et al., 2005; TOIDA et al., 2005; PIRES et al., 2007). A maioria dos tumores de glândulas salivares menores apresentam um comportamento bastante variável, muitas vezes caracterizado por recorrências e metástases tardias (SPEIGHT, BARRETT, 2002; BOBBIO et al., 2008; COPELLI et al., 2008).
No presente estudo envolvendo 20 casos de AP e 20 casos de CAC, todos os tumores estavam localizados em glândulas salivares menores. Estudos envolvendo neoplasias com esta localização indicam que o AP é o tumor benigno mais comum (LOYOLA et al., 1995; LOPES et al., 1999; YIH et al., 2005; TOIDA et al., 2005; JABER, 2006; BUCHNER et al., 2007; PIRES et al., 2007; WANG et al., 2007; BARROS et al., 2010; NÓBREGA et al., 2010), com uma taxa de incidência variando de 30,6 a 53% para todos os tumores de glândulas salivares menores e de 59,3 a 95,6% para os tumores benignos desta localização (LOYOLA et al., 1995; LOPES et al., 1999; YIH et al., 2005; TOIDA et al., 2005; JABER, 2006; BUCHNER et al., 2007; PIRES et al., 2007; WANG et al., 2007). Estudos tem reportado o CAC (EVESON, CAWSON, 1985; TAKAHASHI et al., 1990; TOIDA et al., 2005; WANG et al., 2007; COPELLI et al., 2008; BARROS et al., 2010) e o carcinoma mucoepidermóide (LOYOLA et al., 1995; LOPES et al., 1999; YIH et al., 2005; JABER, 2006; BUCHNER et al., 2007; PIRES et al., 2007; NÓBREGA et al., 2010) como os tumores malignos mais frequentes de glândulas salivares menores. A taxa de incidência para os CACs nestes estudos tem variado de 6,4 a 19,4% para todos os tumores de glândulas salivares menores e de 14,5 a 36% para os tumores malignos desta localização (LOYOLA et al., 1995; LOPES et al., 1999; YIH et al., 2005; TOIDA et al., 2005; JABER, 2006; PIRES et al., 2007; WANG et al., 2007).
Os resultados do presente estudo demonstraram uma predileção dos casos APs e CACs pelo sexo feminino. Os indivíduos com CAC apresentavam uma tendência a desenvolver a doença em idades mais avançadas quanto comparado aqueles com AP. A média de idade dos pacientes com estes tumores no momento de diagnóstico foi de respectivamente 52,56 e 38,69 anos, estando estes achados de acordo com outros estudos (LOYOLA et al., 1995; TOIDA et al., 2005; YIH et al., 2005; JABER, 2006; BUCHNER et al., 2007; PIRES et al., 2007; WANG et al., 2007; BIANCHI et al., 2008; NÓBREGA et al., 2010).
O palato foi a localização mais comum tanto para os APs como para os CACs, com uma alta frequência de envolvimento especialmente para os APs (65%). Estes achados estão de acordo com relatos prévios da literatura que indicam o palato como principal sítio anatômico para ambos os tumores em estudos envolvendo neoplasias de glândulas salivares menores (LOPES et al., 1999; TOIDA et al., 2005; JABER, 2006; YIH et al., 2005; BUCHNER et al., 2007; PIRES et al., 2007, BIANCHI et al., 2008; WANG et al., 2007). Para Toida et al. (2005), devido ao AP representar majoritariamente os tumores benignos envolvendo glândulas salivares menores, características clínicas encontradas nos tumores benignos nas séries de estudos de casos, incluindo a predileção pelo palato e sexo feminino, são devido a presença marcante deste tumor.
Os tumores do presente estudo exibiram aspectos histológicos característicos para estas lesões. Os APs demonstraram uma grande diversidade morfológica, peculiar a estas neoplasias, com um padrão bastante variável dos componentes epitelial e estromal. As células epiteliais e mioepiteliais estavam tipicamente dispostas em lençóis sólidos, cordões, ninhos e estruturas ductiformes. O componente epitelial incluia uma variedade de tipos celulares, incluindo o fenótipo plasmocitóide. O estroma de aspecto diverso assumia os padrões hialino, fibroso, mixóide e condróide. Áreas de diferenciação escamosa e lipomatosa também foram visíveis. Além disso, estes tumores frequentemente apresentavam-se delimitados perifericamente por uma cápsula fibrosa, geralmente delgada e incompleta.
Os CACs também apresentaram um arranjo arquitetural característico com as células proliferantes organizadas formando os três padrões histológicos: cribriforme, tubular e sólido. Nestes tumores também foram evidenciadas invasões das células tumorais a estruturas adjacentes dos tipos muscular, intravascular, perineural e acinar. Estes achados estão de acordo com outros relatos da literatura (DARDICK, 1996; ELLIS, AUCLAIR, 1996; EVESON et al., 2005; SPEIGHT, 2007; ITO et al., 2009).
Para Souza, Araújo (1994), a multiplicidade de aspectos histológicos exibidos pelos TGS tem sido atribuída à presença da célula mioepitelial nas glândulas salivares, pois as neoplasias de pâncreas, glândula que não apresenta este tipo de célula, não demonstram tais variações morfológicas. Embora não seja considerada a célula básica de origem de todos os TGS, acredita-se ser considerável o papel da célula mioepitelial na constituição e crescimento de vários tumores epiteliais salivares (TAKAI et al., 1995; ALOS et al., 1996; DA SILVEIRA et al., 2006).
Nos últimos anos, alguns estudos também têm investigado o papel das células mioepiteliais como supressoras naturais de tumores (STERNLICHT, BARSKY, 1997;
LAKHANI, O'HARE, 2001; BARSKY, 2003). Alguns experimentos in vitro e in vivo revelaram que as células mioepiteliais secretam baixos níveis de proteinases que degradam a MEC e níveis relativamente altos de maspin e diversos outros inibidores de proteinases (STERNLICHT et al., 1996; STERNLICHT, BARSKY, 1997). O maspin é um inibidor de serina proteinase que funciona como um supressor tumoral (BAILEY et al., 2006). Nas glândulas salivares normais o maspin é seletivamente expresso no núcleo e citoplasma de células mioepiteliais (NAVARRO et al., 2004). Nos TGS com diferenciação de células ductais e mioepiteliais como o AP, o adenoma de células basais, o CAC e o carcinoma epitelial-mioepitelial o componente mioepitelial ou mioepitelial modificado geralmente expressa fortemente o maspin, enquanto as células ductais não expressam ou demonstram fraca imunoreatividade focal a este marcador (CHEUK, CHAN, 2007). Variados níveis de expressão do maspin também têm sido evidenciados nos diferentes padrões histológicos do CAC. O padrão tubular apresenta uma alta expressão deste marcador, diferentemente do cribriforme onde apenas algumas células luminais foram positivas e do padrão sólido onde raras células mostraram imunoreatividade para o maspin (NAVARRO et al., 2004). As células mioepiteliais também têm sido associadas à indução da morfogênese epitelial, diferenciação, inibição da invasão tumoral e angiogênese. Desta forma, as propriedades anti- tumorais deste componente celular podem contribuir para a uma tendência a resistência à transformação neoplásica (NGUYEN et al., 2000).
Apesar do AP e CAC compartilharem a mesma origem celular e uma marcante presença de MEC, estes tumores apresentam comportamentos biológicos distintos. O AP é um tumor benigno de glândula salivar enquanto que o CAC é um tumor maligno, com comportamento agressivo e tendência a frequentes recorrências e metástases tardias a distância (BIANCHI et al., 2008; BOBBIO et al., 2008).
Diversos fatores têm sido estudados na tentativa de melhor compreender a patogênese e o comportamento agressivo dos CACs incluindo alterações na expressão de oncogenes, dos genes supressores tumorais e seus produtos protéicos, bem como, nos genes envolvidos nos processos de reparo do DNA. Os fatores reguladores do ciclo celular,asmoléculas de adesão, os fatores angiogênicos e a expressão de MMPs e TIMPs também foram investigados.
Os oncogenes são genes que contribuem para a transformação neoplásica e secretam produtos identificados como fatores de crescimento, receptores de fatores de crescimento, tirosina cinases, proteínas transdutoras de sinal e fatores de transcrição. Esse fatores estão relacionados a proliferação e diferenciação celular(KUMAMOTO et al., 2006). Os produtos resultantes da ativação destes genes atuam de forma dominante, isto é, a mutação de um único
alelo poderá ser suficiente para conferir à célula uma vantagem em termos de crescimento ou transformação, podendo esta mutação levar a neoplasia em uma série de tecidos humanos (WARD, 2002). Um estudo revelou que a maioria dos CACs analisados apresentavam uma expressão alterada do oncogene c-erbB-2, também conhecido com EGFR2 (do inglês, human epidermal growth factor receptor 2) (KARJA et al., 1994).
Os genes supressores tumorais codificam proteínas responsáveis pelo controle negativo do ciclo celular. Estes genes são mais freqüentemente inativados por pontos de mutação, deleções e rearranjos em ambos os alelos (WILLIAMS, 2000). Alterações na proteína retinoblastoma (pRb) são freqüentes em muitos tipos de tumores (PANDE et al., 1988; TSANTOULIS et al., 2007). Quando o Rb está em seu estado hipofosforilado ele funciona inibindo a entrada das células na fase S do ciclo celular, unindo-se e inativando o fator de transcrição E2F (TSANTOULIS et al., 2007). O gene supressor de tumor p16 é um dos responsáveis por regular o ciclo celular e inibir a divisão celular. Esse gene codifica uma proteína que inibe as ciclinas dependentes de quinase, que são necessárias para a fosforilação dos produtos do Rb (SERRANO et al., 1995). Perdas funcionais do p16 e desregulação da pRb foram freqüentes nos CACs em estudos envolvendo TGS (LIGGETT, SIDRANSKY, 1988; ETGES et al., 2004; ZHANG et al., 2005). A expressão do p16 foi reduzida em CACs de alto grau quando comparado aos de baixo grau, estando esta alteração relacionada a progressão destes tumores (ETGES et al., 2004; ZHANG et al., 2005). O gene p53 é um gene supressor de tumor que codifica a proteína P53 e está envolvido na detecção de danos ao DNA, podendo parar o ciclo celular enquanto o dano é reparado ou induzir a apoptose.Para alguns estudos, alterações no gene p53 são pouco freqüentes em CACs, sugerindo que este gene não desempenha um papel importante na tumorigênese desses tumores (KIYOSHIMA et al., 2001; ALVES et al., 2004). Controversamente, um outro estudo observou uma maior freqüência da expressão do p53 em CACs, principalmente no padrão sólido, seguido do cribriforme e tubular(JIA et al., 2004). Um alta frequência de mutações no p53 também foi observada em CACs de alto grau, principalmente no subtipo sólido, quando comparados aos de baixo grau (YAMAMOTO et al., 1998). As alterações no gene p53 quando presentes podem estar relacionadas a um maior número de recorrências ou metástases, indicando um pior prognóstico nestes tumores (PAPADAKI et al., 1996; KIYOSHIMA et al., 2001). Pesquisas ainda sugerem uma relação na expressão do p63 e o desenvolvimento de CACs. Um estudo indicou que a isoforma do p63ăconhecidaăcomoă∆N63ăestavaăexpressaăemă80%ă dos CACs estudados enquanto a isoforma TA63 estava presente em apenas 40% destes tumores (MARUYAet al., 2005). Uma maior expressão do p63 também foi observada em
CACs do padrão sólido(EDWARDS et al., 2004), possivelmente devido a maior presença de células com diferenciação mioepitelial neste padrão, as quais se mostravam fortemente reativas para a p63(BILAL et al., 2003).
O DNA humano tem mecanismos de reparo constituídos por pelo menos seis genes conhecidos como o hMSH2, hMLH1, hMSH3, hPMS1, hPMS2 e GTBP/hMSH6. Defeitos em alguns destes genes podem estar relacionados a tumorigênese dos TGS. Um estudo revelou que alterações nos genes hMSH2 e hMLH1 podem estar associadas a patogênese do CAC(CASTRILLI et al., 2002).
A regulação do ciclo celular está sob controle de estímulos extrínsecos e intrínsecos, coordenados principalmente pelos fatores de crescimento e pelas ciclinas dependentes de quinases. A expressão do EGFR (do inglês, epidermal growth factor receptor) em TGS varia de 37 a 85% (GIBBONS et al., 2001; VERED et al., 2002; KATOPODI et al., 2003; SORENSEN et al., 2006), com altas expressões em CACs (VERED et al., 2002; SORENSEN et al., 2006) e carcinomas mucoepidermóides(GIBBONS et al., 2001; VERED et al., 2002). Uma expressão alterada do c-kit, um receptor transmembrana tirosina cinase tipo III, também tem sido observada em diversos estudos envolvendo TGS, incluindo CACs (HOLST et al., 1999; PENNER et al., 2002; MINO et al., 2003; FREIER et al., 2005; ANDREADIS et al., 2006; ETTL et al., 2008; NEGRI et al., 2008). O NGF (do inglês, nerve growth factor) é um polipeptídeo neurotrópico que promove a sobrevivência e desenvolvimento de muitos tipos celulares neuronais no sistema nervoso central e periférico. O NGF é preferencialmente unido ao receptor neurotrofina tirosina cinase A (TrkA) por uma ligação de alta afinidade. Uma superexpressão de c-kit e TrkA, bem como, a presença de seus ligantes também foi observada em CACs(NEGRI et al., 2008). A superexpressão de NGF e TrkA em células neoplásicas do CAC sugere que este receptor pode funcionar com um fator quimiotático selecionando as células responsáveis pela invasão perineural nestes tumores (WANG et al., 2006). A expressão anormal do TGF , nas suas isoformas TGF 1 e TGF RI, também parece ter um papel importante no desenvolvimento do CAC. A superexpressão do TGF 1 e a baixa expressão de TGF RI podem ainda estar relacionadas com o pior comportamento biológico deste tumor(GUO et al., 2002). Alguns estudos encontraram uma superexpressão da proteína ciclina D1 em CACs (ZHOU, GAO, 2006; GREER et al., 2007). Entretanto, não foi detectado um aumento significativo na expressão do gene da ciclina D1 (CCND1), responsável pela codificação desta proteína nestes tumores. Tal achado sugere que o CAC utiliza um ou mais mecanismos alternativos para produzir o aumento na expressão da proteína ciclina D1(GREER et al., 2007). Outros genes inibidores das ciclinas dependentes de
quinases além do p16, como os genes p15, p18, p19, p21 e p27 também parecem estar envolvidos na tumorigênese dos CACs (TAKATA et al., 1999; KEIKHAEE et al., 2007; DAA et al., 2008). Estudos sugeriram que a diminuição da expressão da proteína p27 foi relacionada ao desenvolvimento e a ocorrência de metástases nestes tumores (TAKATA et al., 1999; KEIKHAEE et al., 2007). A expressão do Bcl-2, uma oncoproteína inibitória de apoptose é ligeiramente maior nos padrões sólido e cribriforme do CAC. Considerando que o Bcl-2 desempenha um papel importante na regulação da apoptose, esta proteína pode funcionar como um marcador de prognóstico nos CACs(JIA et al,. 2004).
Moléculas de adesão celular são encontradas na superfície de todas as células e têm um importante papel nas interações célula-célula e célula-MEC (LYONS et al., 2005). Várias famílias de moléculas de adesão têm sido identificadas como a superfamília das imunoglobulinas (CAMs), caderinas, integrinas, CD44 e selectinas. Estas moléculas estão envolvidas em processos como crescimento, proliferação, organização espacial e migração, tanto em condições fisiológicas como patológicas incluindo inflamação, invasão tumoral e metástases (LYONS, JONES, 2007). Estudos indicam que uma redução na expressão da proteína ICAM-1 (do inglês, intercellular adhesion molecule 1, conhecida como CD54), está associada com o aumento de metástases a distância e a um pior prognóstico em CACs (SHIRAI et al.,2003; LYONS et al., 2005; XUE et al., 2005). O aumento da expressão da proteína VCAM-1 (do inglês, vascular cell adhesion protein 1, conhecida como CD106) em CACs também tem sido associada com o nível de metástases nestes tumores (XUE et al., 2005). Uma associação entre metilação do gene da E-caderina e uma redução da expressão desta molécula também foi encontrada nestes tumores (MARUYA et al., 2002; ZHANG et al., 2007).
A angiogênese é essencial em processos fisiológicos e patológicos, incluindo embriogênese, cicatrização, inflamação e progressão tumoral (KUMAMOTO, 2006). O VEGF (do inglês, vascular endothelial growth factor) é uma proteína que exerce uma atividade mitogênica específica em células endoteliais, estando diretamente relacionada com o processo de angiogênese. A expressão do VEGF têm sido associada ao prognóstico dos TGS. Linhagens de células de CAC com alto potencial de metástase expressaram maiores níveis de VEGF quando comparadas com as linhagens com menor potencial metastático(LIM et al., 2002).
As MMPs apresentam um importante papel em vários processos fisiológicos e
patológicos (POLETTE et al., 2004; PATEL et al., 2006; DE VICENTEet al., 2007, TANG et al., 2008). Vários estudos avaliaram a expressão das MMPs em diversos tipos de neoplasias
(SCHMALFELDT et al., 2001; FRANCHI et al., 2002; RAHKO et al., 2004; TANG et al., 2008; SOUZA FREITAS et al. 2009), incluindo os TGS(KAYANO et al., 2004; NAGEL et al., 2004; CHEN et al., 2005; HU et al., 2005; TIAN et al., 2005; WANG et al., 2005; WESTERNOFF et al., 2005; NASCIMENTO, 2006; DE VICENTE et al., 2008; LUUKKAA et al., 2008; LUUKKAA et al., 2009; ZHANG et al., 2009; LUUKKAA et al., 2010). Em condições fisiológicas, estas metaloproteinases geralmente são pouco expressas pelos tecidos enquanto que em processos patológicos, geralmente há superexpressão destas devido especialmente a um desequilíbrio na atividade das MMPs e TIMPs (PEREIRA et al., 2005; NAGASE et al., 2006).
O presente estudo avaliou a expressão imuno-histoquímica das MMPs (-2,-7,-9 e -26) e dos TIMPs (-1 e -2) em APs e CACs de glândulas salivares menores. A técnica da imuno- histoquímica permite o estudo da presença de MMPs no parênquima e estroma tumoral, combinando os aspectos histológicos aos imuno-histoquímicos. Entretanto, este método não permite avaliar a atividade enzimática das MMPs, discriminando as suas formas latentes e ativas. Devido a atividade enzimática ser mais informativa do que a antigenicidade, alguns autores tem utilizado a zimografia em seus estudos (KAYANO et al., 2004; NAGEL et al., 2004; CHEN et al., 2005; TIAN et al., 2005). No entanto, Ikebe et al. (1999) demonstraram que a atividade gelatinolítica das MMPs -2 e -9 detectada pela zimografia foi significativamente correlacionada com o grau de marcação imuno-histoquímica detectada em cortes congelados dos mesmos espécimes de biópsia. A imuno-histoquímica apresenta vantagens porque permite a correlação direta dos seus achados com a morfologia, além de poder ser realizada em espécimes parafinados tornando o método mais prático para estudos envolvendo MMPs e TIMPs.
Dentre as MMPs, em especial as gelatinases (MMPs -2 e -9), parecem assumir um papel importante no desenvolvimento e no comportamento dos TGS, participando ativamente das interações entre as células epiteliais e os componentes mesenquimais(KAYANO et al., 2004; NAGEL et al., 2004; CHEN et al., 2005; HU et al., 2005; TIAN et al., 2005; DE VICENTE et al., 2008; LUUKKAA et al., 2008; LUUKKAA et al., 2009; ZHANG et al., 2009).
No presente estudo, ao se avaliar a expressão imuno-histoquímica das MMP-2 e -9 em APs e CACs, observou-se que a maioria dos APs exibiu uma forte expressão destas duas gelatinases no parênquima tumoral, assim como os CACs. Entretanto, apenas a MMP-9 demonstrou uma diferença significativa de expressão entre os dois tipos de tumores, apresentando o CAC uma marcação mais intensa para esta gelatinase (p=0,041).
A MMP-9 é capaz de degradar várias proteínas da MEC incluindo a laminina, o colágeno IV e a fibronectina. A MMP-2 além destas proteínas, também é capaz de clivar a tenascina (STERNLICHT, WERB, 2001; KERKELA, SAARIALHO-KERE, 2003; FOLGUERAS et al., 2004). Alguns estudos revelaram a expressão destas proteínas em APs e CACs (RAITZ et al., 2003; FELIX et al., 2004; BENTO et al., 2006), sugerindo que a expressão destas gelatinases nos tumores do presente estudo pode estar relacionada ao processo de remodelação tecidual em ambos os tumores. Porém, apenas a MMP-9, significativamente expressa nos CACs, parece estar envolvida no comportamento mais agressivo destes tumores. Estes achados estão de acordo com o estudo de Vicente et al. (2008), que encontraram uma alta expressão da MMP-9 em tumores malignos de glândula salivar, incluindo os CACs.
Por outro lado, outros estudos revelaram uma alta expressão tanto da MMP-2 como da MMP-9 em tumores malignos e benignos de glândulas salivares. Nagel et al., (2004) evidenciaram uma elevada expressão da MMP-2 em tumores malignos (carcinomas mucoepidermóides, carcinomas de células basais e adenocarcinoma polimorfo de baixo grau) quando comparados aos APs (p=0,0028). Tian et al. (2005), encontrou uma expressão significativamente mais alta das MMPs-2 e -9 em carcinomas quando comparados aos APs (p<0,05). Zhang et al., (2009), encontraram uma expressão mais alta das MMPs -2 e -9 em células mioepiteliais do estroma tumoral dos APs, sugerindo que estas células poderiam ter um papel importante no desenvolvimento e progressão destes tumores.
No presente estudo, além de expressas no parênquima tumoral, as MMPs-2 e -9 também foram imunoreativas em células estromais. A expressão da MMP-2 foi evidenciada em fibroblastos e células endoteliais enquanto a MMP-9 foi expressa principalmente em células inflamatórias presentes no estroma tumoral. Estudos na literatura demonstraram a expressão da MMP-2 em vários tipos celulares, incluindo fibroblastos, macrófagos, ceratinócitos, células endoteliais, células epiteliais, condrócitos, osteoblastos e monócitos. A expressão da MMP-9 foi descrita em macrofágos, neutrófilos, eosinófilos, leucócitos, osteoclastos e ceratinócitos (MATTU et al., 2000; OPDENAKKER et al., 2001; XU et al., 2005; AM LINEIăet al., 2007; NÖEL et al., 2008).
Segundo alguns autores, no processo de invasão tumoral tanto é importante a degradação da MEC através da proteólise, como a interação das células tumorais com os componentes celulares e estruturais ao redor do tumor (KESSENBROCK et al., 2010;
RODRÍGUEZ et al., 2010). A literatura é concordante quanto ao papel do microambiente
ou sinergismo entre as células neoplásicas e estromais na produção de MMPs (FRANCHI et al., 2002; DE VICENTE et al., 2005; ZIGRINO et al., 2005). Para Lynch e Matrisian (2002), as MMPs de origem tumoral ou estromal podem processar moléculas da superfície celular, proteínas, fatores de crescimento e citocinas armazenadas na MEC, causando alterações no microambiente, favorecendo assim o crescimento tumoral, migração, invasão, angiogênese e seleção de clones celulares resistentes a apoptose. Desta forma, estes autores acreditam que as MMPs podem ser utilizadas como um meio de comunicação entre as células tumorais e estromais.
Alguns estudos sobre a expressão da MMP-9 em TGS malignos sugerem que estes tumores são heterogêneos no seu potencial de produzir a gelatinase B. Devido a produção de MMPs por células normais ser regulada por fatores de crescimento e citocinas (KERR et al., 1998), a heterogeneidade na expressão de MMP-9 em células dos TGS pode ser causada por