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Marcadores baseados no polimorfismo da seqüência de DNA se tornaram uma ferramenta comum nas últimas décadas para a genotipagem de indivíduos e para análises de diversidade genética de populações naturais e de melhoramento, análises de estrutura genética e análises de parentesco e identificação clonal. Entre os diversos marcadores desenvolvidos nos últimos anos, os microssatélites e os SNPs são os mais adequados para estas finalidades, fornecendo dados robustos e acurados para a identificação individual e a utilização dessa informação para a determinação de propriedade intelectual.

Os marcadores microssatélites são atualmente os marcadores mais utilizados para análises de identificação individual e análise de parentesco em Eucalyptus (KIRST, CORDEIRO et al., 2005). O multialelismo aliado à alta taxa de transferibilidade entre espécies e à herança mendeliana e co-dominante faz esses marcadores os mais informativos para a determinação de perfis únicos de DNA (DNA fingerprintig) e para a avaliação de paternidade em programas de melhoramento envolvendo híbridos e indivíduos aparentados (BRONDANI et al., 1998; STEANE et al., 2001). O uso desses marcadores pode auxiliar nos programas de melhoramento, maximizando os ganhos genéticos em cada ciclo de melhoramento e direcionando a seleção de parentais superiores (CHAIX et al., 2003; OTTEWELL et al., 2005).

O método tradicional para maximizar os ganhos nos pomares de sementes é o estabelecimento de teste de progênies para avaliar a contribuição de um parental para o desempenho de sua progênie com base na capacidade geral e específica de combinação. No entanto, essa metodologia exige um tempo prolongado para se obter os resultados (BRUNE e ZOBEL, 1981). Uma maneira alternativa para estimar a superioridade de parentais de um pomar de sementes é determinar a paternidade de indivíduos superiores para crescimento ou outras características derivados de polinização aberta utilizando marcadores moleculares. Árvores matrizes que apresentam uma alta freqüência de indivíduos superiores, podem ser utilizados para implantar pomares envolvendo exclusivamente árvores com alta capacidade geral e específica de

combinação (GRATTAPAGLIA, RIBEIRO e REZENDE, 2004). Os marcadores podem ser utilizados tanto para a investigação de paternidade em progênie de polinização aberta com controle materno quanto para confirmação de maternidade e paternidade em progênie derivada de cruzamento com controle paterno e materno (CHAIX et al., 2010). Além disso, os marcadores podem ser utilizados para a identificação correta de clones superiores visando à propagação vegetativa em alta escala, evitando erros nos plantios comerciais.

Os microssatélites são úteis e tem sido utilizado para avaliação de paternidade em programas de melhoramento para diversas espécies (DEVEY et al., 2002; JONES et al., 2008). No entanto, apresentam algumas características que dificultam a análise e diminuem a sua precisão. Quanto maior o tamanho da repetição do microssatélite, maior será a distância entre alelos vizinhos e maior será a precisão na determinação dos tamanhos dos fragmentos de DNA durante a eletroforese. Em análises que exigem uma maior acurácia como teste de paternidade e genética forense em humanos, os microssatélites utilizados são no mínimo tetranucleotídeos, ou seja, o tamanho da seqüência que se repete possui pelo menos quatro pares de base (RUITBERG, REEDER e BUTLER, 2001). Entretanto, na maioria das espécies de plantas, as análises de paternidade e identificação individual são realizadas com dinucleotídeos, o que torna difícil a comparação de resultados entre diferentes equipamentos e diferentes laboratórios. Os dinucleotídeos possuem um intervalo de apenas dois pares de base entre alelos vizinhos, uma distancia tão pequena que torna difícil e imprecisa a definição correta dos bins alélicos. Adicionalmente, apresentam uma grande quantidade de stutter (picos fantasma) e frequentemente alelos microvariantes que dificultam ainda mais a declaração precisa de genótipos (EDWARDS et al., 1991; WEEKS et al., 2002). Muito poucas espécies de plantas já foram contempladas com o desenvolvimento de marcadores microssatélitres baseados em SSR de ordem acima de dinucleotideos, com destaque para soja com centenas de trinucleotideos. Para Eucalyptus já foram publicadas baterias de microssatélites tetra-, penta- e hexanucleotídeos com elevado número de alelos e bom poder informativo para a realização de avaliação de paternidade e identificação individual (FARIA et al., 2011).

Os SNPs mostram diversas vantagens sobre os microssatélites e prometem ser um marcador alternativo para esse tipo de análise, uma vez que possuem baixa taxa de mutação, são abundantes no genoma, são passiveis de automação em alta escala, possuem baixa taxa de erro de

genotipagem, menor necessidade de manipulação laboratorial e os ensaios para SNPs específicos podem ser adaptados para diversas tecnologias (HARA et al., 2010; WELLER et al., 2010).

Tradicionalmente, cultivares têm sido caracterizados e distinguidos com base em caracteres morfológicos e bioquímicos como hábito de crescimento, formato da folha, além de outras características morfológicas convencionais e de resistência à doença (SOLLER e BECKMANN, 1983). Embora os caracteres morfológicos sejam importantes para o sistema de proteção de cultivares, eles se mostram impotentes para a distinção do crescente número de cultivares (DIWAN e CREGAN, 1997). Geralmente os programas de melhoramento são realizados por meio do processo de recombinação entre um número restrito de genótipos superiores, o que diminui a variabilidade genética natural da espécie, diminuindo também as diferenças morfológicas entre os novos cultivares (LEFEBVRE et al., 2001; RICE et al., 2010). Apesar do grande potencial presente na utilização tanto de microssatélites quanto de SNPs para complementar os descritores morfológicos, a UPOV (International Union for the Protection of

New Varieties of Plants) ainda não possui diretrizes claras sobre a utilização de marcadores

moleculares para fins de proteção. Sua utilização ainda é limitada na maioria de espécies de plantas cultivadas, mesmo aquelas responsáveis pelas principais commodities mundiais (GRATTAPAGLIA, 2007).

Raros têm sido os trabalhos de desenvolvimento de painéis de SNPs para determinação de paternidade e identificação individual em plantas. Yoon et al. (2007), desenvolveram um painel para soja contendo 23 SNPs com alto poder informativo para identificação individual. Esse painel foi capaz de distinguir todos os cultivares avaliados, incluindo os ancestrais dos cultivares norte americanos, os cultivares modernos norte americanos e um grupo de cultivares coreanos. Adicionalmente, esse painel foi utilizado com sucesso para distinguir indivíduos de quatro grupos de maturação diferentes que possuíam características morfológicas e de pigmentação idênticas. Por outro lado em programas de melhoramento animal, painéis com elevado número de SNPs já foram testados e são utilizados rotineiramente para fins de identificação individual e testes de parentesco. Por exemplo, Werner et al. (2004) genotiparam 531 SNPs em bovinos e selecionaram um conjunto de 37 SNPs que apresentaram poder de exclusão maior que 99,99% e probabilidade de identidade menor que 10-13. Outros trabalhos nessa área já publicados avaliaram o número necessário de SNPs para a identificação de perfis únicos de DNA (HEATON et al., 2002) e compararam o poder informativo entre SNPs e microssatélites (TOKARSKA et al., 2009).