Nas décadas anteriores, os métodos mais utilizados na busca e genotipagem de marcadores SNP eram baseados no método de seqüenciamento Sanger. A detecção de SNPs se dá em geral através do alinhamento de seqüências obtidas de diversos indivíduos com uma seqüência disponível nos bancos de dados ou alinhamento entre diferentes amostras seqüenciadas. Esse processo é limitado pela capacidade de geração e análise de seqüências (CHAN, 2005).
O desenvolvimento de novas tecnologias de seqüenciamento mudou esse cenário, baixando custos e acelerando a velocidade na geração de dados de seqüências. As chamadas tecnologias de seqüenciamento de segunda geração (Roche 454- (MARGULIES et al., 2005); Solexa Illumina – (BENNETT, 2004); ABI Solid -(VALOUEV et al., 2008) são capazes de produzir vastos conjuntos de dados, da ordem de milhões de bases seqüenciadas, em apenas um ensaio altamente automatizado (GANAL, ALTMANN e RODER, 2009). Dessa forma, essas tecnologias aumentaram significativamente a velocidade na descoberta de novos SNPs, e conseqüentemente, a sua aplicação em diversos estudos. No entanto, para espécies em que o genoma não está seqüenciado ou não está disponibilizado, o uso do seqüenciamento de segunda geração para a descoberta de SNPs é mais difícil. Dentro desse contexto, alternativas para prospecção de SNPs em genomas não seqüenciados também já foram propostas. Novaes et al. (2008) desenvolveram uma metodologia para minerar SNPs em seqüências de eucalipto, cujo
genoma ainda não está montado, utilizando a tecnologia de segunda geração Roche 454. Hyten et al. (2010) desenvolveram um método onde combina-se seqüências geradas pelo sistema Roche 454 com seqüências geradas pelo Genome analyser (GA) da Illumina para a prospecção de SNPs em feijão (Phaseolus vulgaris L.). Barbazuk et al. (2007)desenvolveram uma biblioteca de EST com a tecnologia 454 utilizando linhagens de milho e identificaram cerca de 5000 SNPs. Até mesmo para genomas poliplóides já foram desenvolvidos modelos para a mineração de SNPs utilizando as tecnologias de segunda geração (BUNDOCK et al., 2009; OLIVER et al., 2011).
O método mais básico para genotipagem de SNPs em regiões específicas do genoma é baseado na técnica de PCR-RFLP. O fragmento contendo o SNP de interesse é amplificado com iniciadores específicos, purificado e submetido a um tratamento com uma enzima de restrição que reconheça apenas um dos alelos. Geralmente, só é possível genotipar um loco por ensaio (MAEDA et al., 1989). O próximo avanço tecnológico para genotipagem de SNPs surgiu com metodologias que utilizam seqüenciadores automáticos para a realização da eletroforese de produtos de PCR marcados com corantes fluorescentes. Embora essa metodologia tenha trazido um grande avanço, é necessário grande quantidade de trabalho para geração de dados em larga escala (PATI et al., 2004). Ela pode ser útil em casos que seja necessário a genotipagem de poucos locos de interesse específico, uma vez que o custo de um único ensaio não é muito elevado (FARIA et al., 2009).
Metodologias de genotipagem de SNPs baseadas em microarranjos de DNA fabricados através da impressão de oligonucleotídeos em lâminas de vidro trouxeram novos avanços, com aplicações sendo geradas para espécies de interesse pecuário (CHESSA et al., 2007). O desenvolvimento de métodos baseados em microarranjos para a genotipagem de SNPs em grande escala foi inicialmente uma tarefa laboriosa e cara. Um obstáculo técnico era a fase de amplificação por PCR que era requerida para aumentar a sensibilidade para a genotipagem de SNPs (SYVANEN, 2005). Mesmo assim estas tecnologias permitiram a genotipagem de dezenas de marcadores no mesmo ensaio com uma diminuição significativa de mão de obra (HACIA et al., 1999). A tecnologia de microarranjos foi utilizada na área florestal não para a genotipagem, mas sim para avaliar diferenças de expressão gênica em diferentes tecidos e diferentes fases de desenvolvimento em Pinus taeda (WHETTEN et al., 2001). Estudos de mudanças de expressão gênica em diferentes camadas de células de xilema e floema também foram realizados para
gênica em larga escala utilizando microarranjos foram feitos para espécies florestais, como
Populus (ANDERSSON-GUNNERAS et al., 2006; GEISLER-LEE et al., 2006; RALPH et al.,
2006), Pinus (STASOLLA et al., 2004; YANG e LOOPSTRA, 2005) e Eucalyptus (KIRST et al., 2004; DUPLESSIS et al., 2005; KIRST, BASTEN et al., 2005; RANIK, CREUX e MYBURG, 2006).
O desenvolvimento de chips de genotipagem de alta densidade, com milhares de marcadores SNP trouxeram grandes avanços para as análises genéticas abrindo perspectivas para mudanças nas práticas de melhoramento bovino e na utilização da informação genética para a seleção assistida por marcadores (PERTOLDI et al., 2010; WELLER et al., 2010). A grande quantidade de locos avaliados por essa tecnologia permite a busca de grande quantidade de tag SNPs visando cobrir todos os blocos haplotípicos do genoma e permite buscar SNPs com valores de Minor Alelle Frequence (MAF) adequados para a aplicação em diferentes populações (MATUKUMALLI et al., 2009). Várias novas tecnologias para genotipagem de SNPs em alta escala têm sido apresentadas por diferentes empresas. A plataforma de genotipagem da Illumina (GoldenGate assay) desenvolvida nos últimos anos é capaz de genotipar até 1536 locos polimórficos em centenas de indivíduos em apenas um único ensaio. O desenvolvimento de metodologias para genotipar dezenas de milhares de SNPs em um único ensaio trouxe novos benefícios e aplicações, levando também a uma diminuição dos custos de geração de dados (OLIPHANT et al., 2002). Apesar do baixo custo por “datapoint”, a genotipagem de todos os SNPs é realizada em paralelo, o que torna essa técnica inadequada para a genotipagem poucos locos específicos.. Adicionalmente, o desenvolvimento dos painéis de SNPs pela Illumina exige características específicas dos SNPs e de suas sequencias flanqueantes o que pode dificultar a utilização de marcadores SNPs específicos já disponíveis (SHEN et al., 2005).
A genotipagem de SNPs em alta escala trouxe uma nova perspectiva para estudos genético-moleculares aplicados. Até as últimas décadas, diversas aplicações estavam limitadas ao uso de marcadores microssatélites. Hoje, apesar de menos informativos do ponto de vista individual, a genotipagem de centenas de SNPs em um curto espaço de tempo, com elevada automatização e a um custo baixo tornam esses marcadores adequados e bastante promissores para diversas aplicações em culturas agrícolas e espécies florestais. Aplicações incluem a construção de mapas genéticos de alta densidade (ECKERT et al., 2009; HYTEN, CHOI et al., 2010), estudos de associação entre marcador e característica (COCKRAM et al., 2010; LI et al.,
2010; SETTER et al., 2010), investigação da história evolutiva e detecção de estrutura genética em populações naturais (PLATT et al., 2010), avaliação de paternidade e identificação individual e caracterização de germoplasma.