Muntlige presentasjoner

Relativamente pouco se conhece sobre a via biosintética da quitina em insetos ou outros invertebrados, sendo atribuída, principalmente, à dificuldade de se obter preparações solúveis de quitina sintases e a instabilidade da glutamina-frutose-6-fosfato aminotransferase, enzima que fornece o precursor glucosamina da via biossintética da quitina (MUTHUKRISHNAN et al., 2012). A síntese de quitina em inseto é iniciada com a produção de glucose, proveniente da clivagem da trealose pela enzima trealase (EC 3.2.1.28). A última reação da via é realizada pela quitina sintase (EC 2.4.1.16), que catalisa a polimerização da quitina a partir de monômeros ativados de UDP-N-acetilglucosamina (Figura I-2) (MERZENDORFER, 2011).

Em contraste com os estudos de quitina sintases de fungos, nos quais estas enzimas foram bem estudadas e caracterizadas (HENAR VALDIVIESO et al., 1999), os relatos sobre a caracterização de quitina sintases de insetos são bem mais recentes. A primeira sequência de cDNA de quitina sintase descrita para insetos foi a da mosca da fruta, Drosophila

melanogaster em 1998 (THIREOS, 1998). Desde então, cDNAs/ genes de quitina sintases de

várias espécies de insetos foram caracterizados, incluindo Lucilia cuprina, Anopheles

gambiae, Aedes aegypti, Tribolium castaneum e Manduca sexta (revisto por

Figura I-2. Via biossintética da quitina em insetos. A via inicia com trealose, o principal açucar da hemolinfa dos insetos, e termina com o polimero de quitina. A trealose é inicialmente convertida em glucose pela trealase (1) (3.2.1.28). A conversão da glucose em frutose-6-P envolve a hexoquinase (2) (EC 2.7.1.1) e a glucose-6-P-isomerase (3) (EC 5.3.1.9). A partir da Frutose-6-P a via biosintética da quitina se ramifica. A primeira enzima que catalisa este ramo é a glutamina-frutose-6-fosfato aminotransferase (4) (GFAT, EC 2.6.1.16). A reação catalisada pela GFAT converte a frutose-6-P em glucosamina-6-fosfato, pela transferência de um o grupamento amina a partir da L-glutamina e a isomerização frutosamina-6-fosfato resultante. Em seguida, um grupo acetil da coenzima A é adicionado pela glucosamina-6-P-acetiltransferase (5) (EC 2.3.1.4), para se obter a N- acetilglucosamina (GlcNAc)-6-P, cujo fosfato é então transferido a partir do C-6 para o C-1 catalisado pela Fosfo-acetil-glucosamina mutase (6) (EC 5.4.2.3). O resultante GlcNAc-1-P, por fim, é uridinilado pela UDP-GlcNAc pirofosforilase (7) (EC 2.7.7.23), resultando em UDP-GlcNAc, que serve como o substrato para a quitina sintase (8) (CHS, EC 2.4.1.16) (MERZENDORFER; ZIMOCH, 2003). Trealase (1) Trealose -D- glucose Hexoquinase (2) Fosfo-acetil-glucosamina mutase (6) glucose 6-fosfato isomerase

(3) Glutamina-frutose-6-fosfato aminotransferase (4) glucose 6-fosfato Frutose 6-fosfato Glucosamina 6-fosfato N-acetil Glucosamina 6- fosfato Glucosamina-6-fosfato N- acetiltransferase (5) N-acetil Glucosamina 1- fosfato UDP-N-acetilglucosamina pirofosforilase (7) Quitina sintase (8) Quitina UDP-N-acetil Glucosamina

Diversos projetos de sequenciamento de genomas de fungos revelaram a presença de dois a vinte genes de quitina sintases por espécie, as quais foram categorizadas em sete classes (LENARDON et al., 2010). Em fungos, as diferentes quitina sintases possuem funções distintas, incluindo os processos de divisão celular e esporulação, e sua expressão varia ao longo dos estágios de desenvolvimento (HENAR VALDIVIESO et al., 1999; RONCERO, 2002; MARTIN-UDIROZ et al., 2004; KONG et al., 2012).

Em contraste com os genomas de fungos, em todos os genomas de insetos sequenciados até o presente somente dois genes de quitina sintase foram encontrados por espécie, os quais foram agrupados em duas classes de genes, classe A e classe B. A divisão das quitina sintases de insetos em duas classes possui relevância funcional, assim como é bem relatada em fungos a especialização funcional de suas quitina sintases (MARTIN-UDIROZ et al., 2004; KONG et al., 2012). Em insetos, os genes de quitina sintases da classe A especializaram-se na síntese de quitina da cutícula, enquanto os da classe B são especializadas na produção de quitina para a membrana peritrófica (ARAKANE et al., 2008).

As quitina sintases pertencem à família de glicosiltransferases 2 (GT2), da qual também fazem parte as celulases sintases (COUTINHO et al., 2003). As enzimas desta família geralmente utilizam um mecanismo catalítico em que ocorre a inversão da configuração anomérica do açúcar doador (MERZENDORFER, 2011).

Em insetos, a quitina sintase é uma proteína grande, com massa molecular de 160 a 180 KDa, e possuindo um ponto isoelétrico ligeiramente ácido variando de 6,1 a 6,7. Há evidências que assim como outras glicosil-transferases, a quitina sintase na sua forma nativa forma oligômeros com mais de 500 KDa (MERZENDORFER, 2011). A organização geral da sequência proteica de quitina sintases é deduzida da comparação de sequências de aminoácidos provenientes de insetos e fungos (MERZENDORFER, 2006). Esta enzima pode ser dividida em três regiões distintas nomeadas de domínios A, B e C (TELLAM et al., 2000) (Figura I-3). O domínio A está localizado na extremidade N-terminal e apresenta pouca conservação entre sequências de diferentes espécies. Em insetos o domínio A apresenta entre 7 a 10 hélices transmembranas (MERZENDORFER; ZIMOCH, 2003). O domínio B forma um domínio catalítico central, o qual é orientado para o citoplasma, compreende aproximadamente 450 aminoácidos e contém muitas regiões conservadas incluindo as sequências consenso GT2. O domínio C consiste da porção C-terminal da quitina sintase, sendo caracterizado em insetos pela presença de sete hélices transmembranas conservadas tanto em sequência, localização e espaçamento. Este domínio está provavelmente envolvido na extrusão da cadeia de quitina nascente (MERZENDORFER, 2011).

Figura I-3. Representação esquemática da organização dos domínios da quitina sintase de insetos. Estrutura dos domínios e topologia de membrana da quitina sintase 1 de Manduca sexta (Acesso nº. AY062175). As hélices transmembranas estão representadas como barras verticais, as regiões citoplasmática ou extracelular estão descritas como barras horizontais. Os domínios N-terminal, catalítico e C-terminal estão marcados com A, B e C, respectivamente, seguindo a nomenclatura sugerida anteriormente (Tellam et al., 2000). Blocos altamente conservados estão marcados com as respectivas sequências conservadas. A caixa cinza sombreado destaca a região que é afetada pelo exon alternativo nos genes da classe A. As caixas de vermelho, azul e amarelo indicam os supostos locais de N-glicosilação catálise, e coiled-coils, respectivamente. Adaptado de Merzendorfer et al., 2003.

Atualmente, há dois modelos alternativos para a síntese de quitina em insetos (MERZENDORFER; ZIMOCH, 2003). No primeiro modelo, a quitina sintase é transportada para a membrana plasmática por vesículas intracelulares. Após a fusão com a membrana, a quitina sintase é ativada e subsequentemente transloca as cadeias de quitina para o espaço extracelular. No segundo modelo, mais especulativo, a quitina é secretada no lúmen de vesículas especializadas que se acumulam logo abaixo à teia terminal das microvilosidades das células epidérmicas e se funde com a membrana plasmática, quando a quitina precisa ser liberada. Este modelo permite o armazenamento do polímero de quitina e sua rápida liberação, o que pode ser importante para a secreção da matriz peritrófica logo após a alimentação em mosquitos sugadores de sangue (IBRAHIM et al., 2000). Apesar de todo o conhecimento acumulado na última década sobre a síntese de quitina em insetos, muitas questões referentes ao mecanismo de síntese e sua translocação através da membrana ainda não foram esclarecidas.

Diante do exposto, na última década a técnica do RNA interferente se tornou uma importante ferramenta genética que fez com que o estudo funcional de genes em insetos não- modelos se tornasse possível. Diversos trabalhos de validação funcional por RNAi de genes que codificam para enzimas da via de síntese de quitina mostraram que esses genes são essenciais para o desenvolvimento de insetos (ALVES et al., 2010; ZHANG et al., 2010; AMPASALA et al., 2011; ARAKANE et al., 2011). Quando a expressão desses genes foi inibida no coleóptero modelo, Tribolium castaneum, fenótipos letais foram observados (ARAKANE et al., 2008). Portanto, uma vez que a quitina está ausente em plantas e vertebrados, e o desenvolvimento e crescimento dos insetos dependem da biossíntese deste

polímero, a identificação, a caracterização e o uso do silenciamento de genes envolvidos na síntese de quitina, especificamente a quitina sintase do bicudo-do-algodoeiro, apresentam-se como estratégia promissora para o desenvolvimento de novos métodos mais seguros e eficazes de controle desta praga.

2 JUSTIFICATIVA

O cultivo de algodão está entre os maiores segmentos do agronegócio brasileiro. Essa cultura é atacada severamente pelo A. grandis cuja forma larval tem hábitos endofíticos, o que dificulta o controle químico. Portanto, faz-se necessário o desenvolvimento de métodos eficazes e seletivos contra esta praga. O desenvolvimento de plantas resistentes a esse inseto- praga poderia aumentar a produtividade das lavouras e reduzir consideravelmente o impacto ambiental de pesticidas. A busca por genes essenciais dos insetos-praga que possam ser silenciados e interferir no seu desenvolvimento é uma estratégia que vem sendo bastante estudada nos últimos anos. A quitina é um importante carboidrato estrutural, sendo um dos principais componentes da membrana peritrófica e do exoesqueleto dos insetos. A interrupção ou a diminuição da síntese de constituintes destas importantes estruturas quitinosas por meio da tecnologia do RNAi apresenta-se como uma forma específica de controle deste inseto- praga.

3 HIPÓTESE GERAL DA TESE

A síntese de quitina é um processo essencial para a formação de diversas estruturas morfológicas do corpo dos insetos. A redução da expressão das quitina sintases de

Anthonomus grandis, por RNAi pode causar danos incompatíveis com o desenvolvimento do

inseto, acarretando sua morte. Assim, o silenciamento gênico por RNAi pode se tornar um método eficiente no controle desse inseto-praga.

Em se confirmando essa hipótese, o principal benefício desse novo método para o controle do bicudo-do-algodoeiro é a redução dos prejuízos causados por este inseto na cotonicultura nacional, além de reduzir a utilização de agrotóxicos e seus efeitos nocivos ao homem e ao meio-ambiente e, assim, contribuir para a competitividade do agronegócio brasileiro.

Essa hipótese está baseada em uma série de relatos científicos que mostraram o potencial deletério causado pelo silenciamento de genes de quitina sintases em outros insetos- praga (ARAKANE et al., 2005; ALVES et al., 2010; AMPASALA et al., 2011).

4 OBJETIVOS