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Um dos principais objetivos de investigações básicas associadas ao manejo integrado de pragas é a perspectiva de entender e interferir nos processos vitais do inseto (genéticos, bioquímicos e morfofisiológicos), de modo que tal interferência possua escassa ou nenhuma influência sobre outros animais e, ao mesmo tempo, possa servir como instrumento potencial para o controle de espécies prejudiciais (CRUZ et al., 2000). Dentro desta perspectiva o sistema digestório dos insetos é uma importante região de exposição com o meio ambiente, e dessa forma, estratégias que possam interferir na bioquímica e fisiologia desta região, visando à redução de absorção de nutrientes, seriam ferramentas potencialmente eficientes no manejo de pragas (SHEWRY; LUCAS, 1997).

O trato digestório animal está exposto a uma variedade de agentes nocivos de natureza química, física e biológica, necessitando de mecanismos para a sua proteção. Nos vertebrados, o muco é uma secreção que recobre e protege o epitélio intestinal, enquanto auxilia o processo de digestão. Nos insetos, entretanto, não se observa uma camada mucosa propriamente dita recobrindo o epitélio intestinal, em seu lugar, o intestino médio dos insetos é protegido por uma estrutura acelular e semipermeável denominada membrana peritrófica ou matriz peritrófica ou, ainda, gel peritrófico (PETERS, 1992; LEHANE, 1997; TERRA, 2001). A membrana peritrófica é uma estrutura mucosa (WANG; GRANADOS, 1997), que difere do muco dos vertebrados pela incorporação de quitina, resultando em uma estrutura protéica reforçada por fibrilas de quitina (PETERS, 1992; TELLAM et al., 1999). É constituída principalmente por glicoproteínas e proteoglicanos (20-55%) e por quitina (3-40%) (KRAMER et al., 1995; LEHANE, 1997) em uma organização que fornece semi- permeabilidade e elasticidade a estrutura (LEHANE, 1997). A quitina é um importante componente estrutural da membrana peritrófica, além de fornecer rigidez, serve também como sítio de ancoragem para proteínas, como as peritrofinas (WANG; GRANADOS, 2001).

Essas proteínas interagem com outras peritrofinas mediada por sua ligação a oligossacarídeos contendo N-acetil-D-glucosamina e, desta maneira, uma malha tridimensional de interação de glicoproteínas poderia ser formada e contribuir para as características estruturais como força, elasticidade e porosidade que são observadas nas membranas peritróficas (TELLAM et al., 1999).

A membrana peritrófica, em insetos pode ocorrer em duas formas, definidas quanto ao seu sitio de síntese: Tipo I e Tipo II (WIGGLESWORTH, 1972; PETERS, 1992). A

membrana peritrófica do tipo I, produzida por muitos insetos adultos hematófagos e coleópteros, é sintetizada por células epiteliais do intestino médio, sendo produzida em resposta a ingestão de alimento, que por descamação da superfície epitelial, dá origem a uma estrutura em forma de bolsa que recobre o alimento (LEHANE, 1997). O Tipo II de membrana peritrófica é produzido a partir de um pequeno órgão altamente especializado chamado de cárdia situado na região anterior do intestino médio. Este tipo de membrana peritrófica é constitutivamente produzido como um contínuo tubo com estrutura altamente organizada (PETERS, 1992; TELLAM; EISEMANN, 2000).

As principais funções atribuídas a esta membrana são a de proteção mecânica contra injúria às células do intestino médio (WIGGLESWORTH, 1972), uma barreira física contra microorganismos (PETERS, 1992), uma barreira seletiva para enzimas digestivas e produtos de digestão (DAY; WATERHOUSE, 1953) e atua no mecanismo de reciclagem de enzimas digestivas, fenômeno conhecido como circulação endo-ectoperitrófica (TERRA, 1988; TERRA; FERREIRA, 1994; BOLOGNESI et al., 2001; TERRA, 2001).

Devido suas importantes funções fisiológicas, a membrana peritrófica é considerada um importante alvo estrutural para o estabelecimento de estratégias de controle de insetos (WANG; GRANADOS, 2001). Diversos estudos de caracterização da estrutura e composição das membranas peritróficas de insetos das diferentes ordens culminaram no acúmulo de conhecimento para o desenvolvimento de alternativas, visando causar-lhes alterações estruturais.

Diversos relatos demonstram que a interrupção da formação da membrana peritrófica por agentes capazes de se ligar na quitina presente nessa estrutura, e competir pelos sítios de ligação com as peritrofinas, ou ainda, degradar a quitina, podem alterar suas propriedades funcionais como a proteção química e mecânica do epitélio intestinal. Danos a membrana peritrófica acarreta um aumento da suscetibilidade e mortalidade dos insetos por agentes infecciosos como vírus e bactérias, além de interferir na assimilação de nutrientes (POWELL et al., 1998; WANG; GRANADOS, 2000; BOLOGNESI et al., 2001). Assim, a quitina, sendo um dos componentes majoritários do arcabouço estrutural da membrana peritrófica, é considerada a principal molécula alvo da membrana peritrófica.

Devido à importância da quitina e das enzimas envolvidas na sua biossíntese no crescimento e metabolismo de insetos, o estudo sobre as quitina sintases recebeu grande atenção nos últimos anos, principalmente visando à inibição de sua atividade como estratégia

inseticida. Inibidores da síntese de quitina são capazes de interferir na constituição de estruturas quitinosas em insetos. Atualmente, essas moléculas são consideradas potentes agentes de controle sobre insetos-praga, e se enquadram dentro do grupo de reguladores de crescimento. Por exemplo, o Diflubenzuron, inibidor da enzima quitina sintase, tem sido utilizado com sucesso como inseticida sobre larvas de mosquitos (FOURNET et al., 1993). A utilização desses inibidores em escala comercial ainda é controversa, pois como possuem um amplo espectro de ação acarretam impacto sobre organismos não-alvos (CAMPICHE et al., 2006; CAMPICHE et al., 2007).

No entanto, o conteúdo de quitina em membrana peritróficas de insetos pode ser afetado por quitinaes, resultando em mortalidade larval (KRAMER; MUTHUKRISHNAN, 1997; DING et al., 1998) e, portanto, habilitando a estratégia de super-expressão de quitinaes em variedades transgênicas visando o controle de insetos (DING et al., 1998). Apesar de existir diversos relatos científicos do sucesso da utilização de quitinaes em plantas GM como fator de resistência a insetos-praga (KRAMER; MUTHUKRISHNAN, 1997), sua utilização em escala comercial foi restrita, devido ao fato das toxinas Bt se mostrarem mais eficientes e especificas.

Atualmente, vem se estudando a possibilidade de interferir na síntese de quitina de membrana peritrófica por meio da técnica do RNAi. O advento do RNAi permitiu o estudo funcional de diversos genes nos mais diferentes insetos (MITO et al., 2011). Dentre esses genes, diversos relatos na literatura científica mostraram o potencial uso da estratégia de silenciamento gênico utilizando a quitina sintase da classe B (ou tipo II) como alvo para o desenvolvimento de novos métodos de controle de insetos-praga (ARAKANE et al., 2008; ALVES et al., 2010).

Até o momento, nada se conhece sobre o metabolismo de quitina em A. grandis, tampouco sobre a fisiologia de sua membrana peritrófica. A importância da membrana peritrófica para este inseto será discutida nesse capítulo, que tem ainda como objetivos i) o sequenciamento e a caracterização do cDNA da quitina sintase 2 de A. grandis ii) o estudo de sua expressão durante o desenvolvimento do inseto e iii) a inibição de sua expressão visando promover a diminuição do conteúdo de quitina de sua membrana peritrófica. O estudo das características funcionais da membrana peritrófica neste inseto poderá prover novos conhecimentos para o desenvolvimento de estratégias que visem alterar essa importante estrutura no intestino de A. grandis.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

O objetivo geral desse capítulo é o sequenciamento do cDNA da quitina sintase II de

A. grandis, bem como obter uma caracterização funcional de sua expressão ao longo do

desenvolvimento do inseto e avaliar o seu potencial como alvo para estratégias de controle desta praga.