Espécies reativas de oxigênio (ROS), como o ânion superóxido (O2.-), peróxido de
hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (•OH), podem ser geradas endogenamente como no
processo de fosforilação oxidativa mitocondrial, ou por meio de agentes exógenos, tais como compostos xenobióticos.117 Quando ROS sobrecarregam o sistema de defesa antioxidante
celular, ocorre o estresse oxidativo. O estresse oxidativo resulta em danos a ácidos nucléicos, proteínas e lípidos, e tem sido apontado como agente promotor de doenças como Alzheimer, doença de Parkinson e praticamente todas doenças cardiovasculares.117,118
O radical ânion superóxido (O2•⎯) é gerado pela redução de oxigênio molecular,
por meio da adição de um elétron ao orbital *2p da molécula (Figura 56).119 Apesar de ser
um fraco oxidante,55 o O
2•⎯ pode ocasionar sérios danos em biomoléculas, quando associado
com outras espécies radicalares, o mesmo atua como redutor em reações contendo metais de transição, geralmente Fe3+ e Cu2+, e também na produção de fortes oxidantes denominados de
radical hidroxila (•OH) e peroxinitrito (ONOO-), a partir da reação com o NO (Reação
8).120,121
Figura 56 - Versão simplificada da ligação na molécula de oxigênio e seus derivados.
Reação 8
O2•⎯+ NO ONOO- + H+ ONOOOH ●OH + NO2●
Desta forma, a reação do NO com O2•⎯ leva a efeitos pró-oxidantes, induzindo ao
stress oxidativo. Contudo, de uma perspectiva antioxidante, o NO coordenado, particularmente na forma de NO+, pode desviar a reatividade do O
2•⎯ frente a uma molécula-
alvo ou inibir reações particularmente citotóxicas. Em baixas concentrações, ONOO- pode
atuar como uma molécula de sinalização, que explica os efeitos citoprotetores que têm sido relatados em ambos os sistemas vasculares e plaquetários.120
A produção do radical ânion superóxido pode ser mediada através da enzima xantina oxidase (XOD) e a hipoxantina, uma vez que enzima cataliza a oxidação do substrato hipoxantina usando oxigênio e levando-a a xantina, em etapas posteriores a enzima oxida o produto xantina a ácido úrico, somando estas duas etapas temos a produção de dois equivalentes do radical O2•⎯ (Reação 9).119
Reação 9
Ensaios in vitro têm demonstrado a redução do ferricitocromo c (Cit-c FeIII) pela
espécie química O2•⎯, a redução do citocromo c pelo íon superóxido é bastante seletiva e
acarreta no surgimento de uma banda característica em 550 nm, correspondente ao estado de oxidação Fe2+ do grupo heme (Cit-c FeII). Uma vez que essa espécie pode causar danos aos
sistemas biológicos, como citado anteriormente, é promissora a utilização de tal metodologia para a investigação de agentes que possam funcionar como sequestradores de O2•⎯.122
Com o objetivo de verificar se o complexo precursor trans-[Fe(cyclam)Cl2]+ e o
complexo trans-[Fe(cyclam)(NO)Cl]2+ possuem algum efeito sequestrante de O
2•⎯, foram
para eliminação de possíveis traços de peróxido de hidrogênio (H2O2), que eventualmente são
gerados durante a reação enzimática. As medidas cinéticas foram realizadas através do monitoramento da banda em 550 nm, correspondente ao surgimento do produto Cit-c FeII
quando em reação com superóxido.
A ação sequestradora de O2•⎯ dos complexo trans-[Fe(cyclam)Cl2]+ e trans-
[Fe(cyclam)(NO)Cl]2+ foi avaliada por meia da utilização de uma mistura contendo xantina
oxidase (0,13 mol L-1) e hipoxantina (122 mol L-1), para produção de O
2•⎯, catalase (0,4
mol L-1) para eliminação de traços de H
2O2 gerados, e citocromo c (64 mol L-1). As reações
foram realizadas em tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,4 a 37 °C durante 60 minutos. Foram
realizados controles reacionais onde a mistura acima descrita foi empregada na ausência dos complexos metálicos.
Os ensaios com o íon complexo trans-[Fe(cyclam)Cl2]+ foram realizados
utilizando 300 e 500 mol L-1. Os resultados foram expressos nas formas de curvas cinéticas
da Absmax em 550 nm versus o tempo de reação (Figura 57).
Figura 57 - Efeito dos complexos como possíveis sequestradores de O2•⎯. Os resultados foram
expressos em absorbância vs tempo (minutos), considerando a máxima formação de O2•⎯ em
550 nm, através da redução do Citocromo-c, comparados ao controle (ausência de complexo). As reações ocorreram num período de 60 minutos. (A) Reações na presença de 0 (●), 300 (■) e 500 mol L-1 (▲) do complexo trans-[Fe(cyclam)Cl
2]+. (B) Reações na presença de 0 (●),
100 (■), 200 (▲), 300 (▼), 400 (♦) e 500 mol L-1 (●) do complexo trans-
[Fe(cyclam)(NO)Cl]2+. As demais espécies utilizadas em todas as reações foram: Xantina
Oxidase (0,13 mol L-1) e Hipoxantina (122 mol L-1), Catalase (0,4 mol L-1) e Citocromo-
C (64mol L-1). Temperatura de 37 °C. 0 10 20 30 40 50 60 0.15 0.25 0.35 0.45 (A) Tempo (minutos) A b s ( 5 5 0 n m Ci t- c ) 0 10 20 30 40 50 60 0.16 0.24 0.32 0.40 (B) Tempo (minutos) A b s ( 5 5 0 n m Ci t- c )
Na Figura 57A, observou-se idêntico perfil das curvas cinéticas de detecção de superóxido, sugerindo que o complexo trans-[Fe(cyclam)Cl2]+, mesmo na máxima
concentração de 500 mol L-1, não apresentou qualquer efeito frente ao íon superóxido.
A atividade sequestradora de O2•⎯ promovida pelo íon trans-
[Fe(cyclam)(NO)Cl]2+, foi avaliada utilizando 100, 200, 300, 400 e 500 mol L-1 de
complexo. A Figura 57B exibe as curvas cinéticas obtidas (Absmax em 550 nm versus o
tempo) para cada concentração de nitrosilo complexo, o que pode ser comparado ao da reação na ausência do complexo. Com o aumento de concentração do complexo no meio, observou- se um incremento da ação supressora do sistema superóxido/citocromo c. A concentração mínima do complexo trans-[Fe(cyclam)(NO)Cl]2+ necessária para reduzir em 50% a
concentração máxima de geração de O2.- (IC50), que foi calculada a partir da curva sigmoidal
do percentual da Absmax em 550 nm versus o logaritmo decimal da concentração de complexo
(Figura 58), foi 300 mol L-1 (± 1,05) (R2 = 0,9725). Neste caso como o complexo apresentou
efeito sobre o sistema superóxido/citocromo c, seria necessário a realização do experimento na ausência de citocromo c para excluir qualquer atividade de inibição da enzima xantina oxidase ou reação com a hipoxantina.
Figura 58 - Curva de atividade sequestradora de O2.- para o íon complexo trans-
[Fe(cyclam)(NO)Cl]2+ em diferentes concentrações. IC
50 = 300 mol L-1 (± 1,05) (R2 = 0,9725).
1.95
2.10
2.25
2.40
2.55
2.70
0
20
40
60
80
100
R
2= 0.9725
log [complexo]
A
b
s
(
%
)
A marcante diferença de reatividade entre o complexo trans-[Fe(cyclam)Cl2]+ e
trans-[Fe(cyclam)(NO)Cl]2+, pode ser atribuída a presença do ligante NO+ coordenado, que
por sua vez pode reagir com o ânion radical O2•⎯, consumindo-o e assim bloqueando sua
reação com o Cit-c FeIII. Tais resultados revelam que o nitrosilo complexo trans-
[Fe(cyclam)(NO)Cl]2+ em condições fisiológicas pode atuar como possível agente
antioxidante.